基于顶空固相微萃取-气相色谱-质谱和主成分分析法研究不同发酵原料对草莓酒香气成分的影响

李涛，周颖，张军，杨梅，冯翰杰，张顺屹，杜晴云

(天津农学院 食品科学与生物工程学院，天津，300392)

草莓是蔷薇科多年生草本植物，果实呈鲜红色，香气浓郁，富含维生素、花色苷和酚类物质，具有防便秘、抗氧化及预防心脑血管疾病等功效，被誉为“水果皇后”[1-2]。果酒是以水果为原料，经调整成分，酒精发酵等工艺酿制而成，其营养丰富、色泽诱人，适量饮用有助于身体健康[3]。以草莓为原料酿造的草莓果酒，既可以丰富果酒市场，提高草莓的利用率和附加值，也可以解决草莓不耐储藏、货架期短等问题。目前国外关于草莓酒的研究少有报道，而国内对草莓酒的研究主要集中在酿造工艺的优化[4]和酵母菌种的筛选[5]等方面。跟葡萄酒相比，草莓酒的发酵工艺还不成熟，市面上草莓酒的种类较少。不同发酵工艺对果酒的香气品质有很大的影响。周雪艳等[6]发现不同发酵方式(清汁发酵、浊汁发酵、带渣发酵、加酶带渣发酵)对鸭梨酒的香气成分种类及其含量具有显著影响，青汁发酵的鸭梨酒品质更优。傅力等[7]以赛买提杏为原料，采用杏汁和杏浆2种不同发酵方式进行发酵，结果表明杏汁发酵的杏酒酒体柔和丰满，感官品质较好，而杏浆发酵的酒口感较粗糙。

顶空固相微萃取(head space solid-phase micro-extraction，HS-SPME)技术作为样品前处理方法，具有操作简单、高效、成本低等优点[8]，该技术常与GC-MS联用，用于快速分析物质中的挥发性成分，目前在生命科学、食品、药品、化工、香精油等方面具有广泛应用[9]。香气是评价果酒感官品质的重要指标，决定着产品的风格与典型性，其受原料品种、发酵方式、酵母种类、澄清工艺、储藏条件等因素影响[10]。叶文斌等[11]采用HS-SPME-GC-MS对东方草莓酒挥发性香味成分进行分离和鉴定,共鉴定出32种香气物质，其中异戊醇、2-甲基丙醇、正丙醇、乙缩醛二乙醇、乳酸乙酯、乙酸乙酯等物质为草莓酒的主要香气成分。时宽芹[12]通过HS-SPME-GC-MS方法分析了法兰地草莓酒的挥发性成分及含量，样品中共检测出78种香气物质，其中酯类和醇类含量最多，乙酸异戊酯、乙酸己酯、辛酸乙酯和乙醛的气味活性值较高，对草莓酒风味有重要贡献。

本研究以红颜草莓为原料，采用HS-SPME-GC-MS和主成分分析方法对草莓汁及草莓酒进行香气成分分析，研究2种不同发酵原料(去梗草莓和带梗草莓)对草莓酒基本理化指标、香气成分和感官特性的影响，以期为进一步研究草莓酒的工艺优化及香气成分分析提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草莓，2021年4月中旬采于北京欣宝莱科技有限公司，总糖质量浓度为108 g/L，总酸质量浓度为6.25 g/L(以酒石酸计)，挑选成熟度好、无污染无破损的新鲜红颜品种草莓为原料。

果胶酶(食品级)、DL-酒石酸，河南万邦实业有限公司；F15酵母、焦亚硫酸钾(食品级)，法国Laffort公司；白砂糖，北京糖业烟酒集团有限公司；福林-酚试剂，天津市光复精细化工研究所；2-辛醇(色谱纯)，上海泰坦科技股份有限公司；NaCl、NaOH、HCl、葡萄糖等试剂均为国产分析纯，上海国药集团试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GC-7890气相色谱质谱联用仪，美国安捷伦科技有限公司；HH系列数显型恒温水浴锅，江苏科研仪器有限公司；HPX-250生化培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；雷磁pHS-25型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；电子天平，天津天马衡基仪器有限公司；L4紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司；手动破碎机，宜仟家酿酒设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵工艺流程及操作要点

草莓→清洗→轻度破碎→草莓果浆→调整成分→接种酵母→酒精发酵→皮渣分离→清汁发酵→结束发酵→倒灌澄清→除菌过滤→装瓶→测定指标

草莓果浆的制备：挑选成熟度好、无污染无破损的新鲜草莓，清水冲洗，去梗发酵先去除草莓果梗及萼片，带梗发酵直接破碎入罐，得到草莓果浆。

调整成分：添加100 mg/L焦亚硫酸钾防止氧化，30 min后加入40 mg/L果胶酶，用白砂糖调整总糖质量浓度为200 g/L，酒石酸调整总酸质量浓度为7.5 g/L(以酒石酸计)。

接种酵母：酵母的接种量为0.2 g/L。将称量好的酵母按料液比1∶10(g∶mL)加入蒸馏水，在37 ℃恒温水浴锅中活化25 min，然后倒入发酵罐中搅拌均匀。

酒精发酵：发酵温度为18 ℃，每隔24 h测一次温度和比重(相对密度)，当果肉接近无色时，皮渣分离。

清汁发酵：分离完皮渣的草莓清汁继续酒精发酵，当连续2次比重不再变化时，发酵结束。

倒罐澄清：倒罐，去除酒泥，加入100 mg/L焦亚硫酸钾终止发酵，4 ℃条件下自然澄清，1个月后过滤装瓶。

1.3.2 基本理化指标的测定

总酸(以酒石酸计)采用指示剂法测定；挥发酸(以乙酸计)采用滴定法测定；pH值采用pH计测定；游离及总SO2采用直接碘量法测定；还原糖(以葡萄糖计)采用斐林试剂法测定；乙醇体积分数采用密度瓶法测定；总酚采用福林酚比色法测定[13]。所有指标均重复测定3次。

1.3.3 挥发性香气成分的测定[14]

香气成分萃取：分别吸取10 mL酒样放于20 mL顶空瓶中，加入2 g NaCl(可促进挥发性香气成分挥发)和10 μL 2-辛醇内标(质量浓度为500 μg/L)，置于恒温磁力搅拌加热平台上，45 ℃预热10 min。待顶空瓶中样品香气达到饱和之后，将萃取头伸入顶空瓶中，45 ℃吸附40 min后拔出，插入气相色谱进样口，230 ℃热解析3 min。最后进行数据采集分析。

色谱条件：色谱柱为DB-WAX毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气He(纯度为99.999%)，流速为1 mL/min；手动进样；进样口温度230 ℃；升温程序：起始柱温35 ℃(保持3 min)，以6 ℃/min升温至150 ℃(保持1 min)，再以12 ℃/min升温至230 ℃(保持3 min)。

质谱条件：电子电离源(electron ionization,EI)，电子能量70 eV；扫描范围m/z20～550；离子源温度230 ℃；接口温度230 ℃。

草莓汁挥发性香气成分的测定方法同草莓酒。

1.3.4 香气成分分析[15]

定性：通过查阅相关文献和计算机谱库(NIST/Wiley)检索，对GC-MS分析得到的质谱数据进行定性(匹配度>800，最大值为1 000)。

定量：采用半定量法，以2-辛醇(质量浓度为500 μg/L)作为内标物，对草莓酒和草莓汁样品中各香气成分进行定量，计算如公式(1)所示：

(1)

式中：ρX，各香气物质的质量浓度，μg/L；A，酒样中测得香气物质的峰面积；ρ，2-辛醇的质量浓度，μg/L；A0，2-辛醇的峰面积。

1.3.5 感官评价

在标准品尝室中，由7名经过专业培训的品尝员组成感官分析品尝小组，参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》对草莓酒进行感官分析。

1.4 数据处理

用SPSS 26.0进行显著性和主成分分析，Excel 2021和Origin 2021进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 发酵原料对草莓酒理化指标的影响

由表1可知，2种不同原料酿造的草莓酒还原糖质量浓度均小于4 g/L，按照GB/T 15037—2006《葡萄酒》理化指标规定，属于干型果酒。酒样中总酸质量浓度均大于8 g/L，pH在3.4～3.6，带梗发酵草莓酒中总酸含量较高，pH值较低，可能是由发酵过程中草莓果梗及萼片中的酸类物质释放到酒中所致。起始糖度一样，而带梗发酵草莓酒中的酒精体积分数显著高于去梗发酵草莓酒，可能是果梗的加入提高了乙醇的转化率所致。从总酚质量浓度来看，带梗发酵草莓酒中含量较高，为(272.5±0.01)mg/L，是去梗发酵草莓酒的1.34倍，据报道，酚类物质主要存在于果梗、果皮和种子中，随着酒精发酵的进行会进入果酒中，赋予果酒收敛感和苦涩味[16]。乙酸对果酒风味品质的影响是负面的，研究发现，乙酸质量浓度在200～700 mg/L较为适宜，而高于700 mg/L时，会使果酒产生酸败感和溶剂味[17]。如表1所示，2种草莓酒中挥发酸质量浓度(以乙酸计)均小于1.2 g/L，符合国标GB/T 15037—2006《葡萄酒》要求，总SO2含量和游离SO2含量也符合GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》限量要求。

表1 草莓酒的理化指标Table 1 Physicochemical indexes of strawberry wines

2.2 发酵原料对草莓酒香气成分的影响

香气是评价果酒品质的重要指标[10]，实验采用HS-SPME-GC-MS技术，对草莓汁及2种草莓酒进行挥发性香气成分测定，结果如表2所示，草莓酒中共检测出40种香气物质，包括醇类7种、酯类18种、酸类3种、醛酮类1种、萜烯类8种、烷类2种和其他类1种，占香气总量的42.43%、49.57%、0.51%、0.28%、5.14%、1.48%和0.59%，其中酯类物质种类最多，含量最高。

2种不同原料酿造的草莓酒样品中，分别检测出35种和29种香气物质，占酒样香气总量的62.32%和37.68%，可见去梗发酵草莓酒中无论是香气种类还是香气总量均高于带梗发酵草莓酒。

表2 草莓汁及草莓酒香气化合物的组成及含量Table 2 Composition and content of aroma compounds in strawberry juice and strawberry wines

醇类物质是构成果酒酒味特征的基本香气化合物，能赋予果酒复杂感，醇类物质一部分来源于果实自身无氧代谢，另一部分来源于酵母菌酒精发酵过程中氨基酸代谢或糖代谢[18-20]。由表2可知，草莓酒样品中共检测出7种醇类物质，有4种为共有物质。醇类物质在带梗发酵草莓酒中含量最高，为68.80%，是其主要香气成分。其中异戊醇是草莓酒中含量最高的醇类物质，赋予草莓酒白兰地香气或辛辣味，特别是在带梗发酵草莓酒中，含量达到了63.12%，研究报道，异戊醇含量过高对果酒的风味会产生不良影响[21]。此外，苯乙醇、2-戊醇在酒样中均检出，它们赋予草莓酒玫瑰香、花香和蜜香[8]。酒样中的正己醇主要来源于草莓果实，在草莓汁样品中也被检出，赋予酒体青草味[21]。

酯类物质是构成果酒的重要香气物质，主要产生于酒精发酵，能赋予果酒浓郁的花香和果香[22]。由表2可知，2种酒样中分别检测出17种和12种酯类物质，有11种为草莓酒中共有，其中去梗发酵草莓酒中酯类物质含量最高，为65.35%，而带梗发酵草莓酒中仅占23.47%，酯类物质是去梗发酵草莓酒中的主要香气物质。辛酸乙酯、癸酸乙酯、正己酸乙酯、丁酸乙酯和肉桂酸乙酯在2种酒样中均检出，且含量均较高，赋予草莓酒青苹果、草莓、菠萝、梨、花香、果香和脂肪味[23]，其中肉桂酸乙酯和丁酸乙酯主要来源于草莓果实，在草莓汁中均检出。乙酸己酯、丁酸芳樟酯、乙酸苯乙酯、5-甲基-壬酸乙酯、癸酸异戊酯和十四酸乙酯仅在去梗发酵草莓酒样品中检出，是该样品的特有香气成分，赋予酒体梨、樱桃、香蕉等清甜水果香[8,21]。

萜烯类物质是一系列萜类化合物的总称，广泛存在于植物体内，具有浓郁的水果香和花香,是水果香气成分中的主要贡献者[24]。如表2所示，萜烯类物质在草莓汁样品中含量最高，为32.61%，而在去梗和带梗发酵草莓酒中含量较低，仅为5.73%和4.15%，萜烯类化合物是草莓汁中的主要香气物质。其中苯乙烯和(+)-α-松油醇仅在去梗发酵草莓酒中检出，是其特有成分，顺-α-红没药烯和α-松油醇是带梗发酵草莓酒中的特有成分，赋予了草莓酒丁香香气。芳樟醇、(Z,E)-A-法尼烯、(E)-β-金合欢烯和红没药醇在2种草莓酒样品中均检出，这些物质主要来自于草莓果实，赋予草莓酒花香和薰衣草香[21]。

除此之外，2种酒样中还检测到酸类、醛酮类、烷类和其他类挥发性香气物质，这些挥发性物质在草莓酒样品中含量较低，对草莓酒的香气起着重要的补充和修饰作用[25]，如图1所示。

图1 各类香气物质的总量Fig.1 The total amount of various aromatic substances

2.3 主成分分析

按照主成分选取标准，通常把累计贡献率超过85%的主成分提取出来，如表3所示，3个样品中共提取了2个主成分，其中第1主成分贡献率为70.47%，第2主成分贡献率为29.53%，二者累计方差贡献率为100%，可以解释原变量所有的变异信息[21]。

表3 主成分分析中解释的总方差Table 3 The total variance explained in PCA

如表4所示，3种样品中因子载荷量>0.750的物质共有63种。第1主成分有41种，其中31种物质来自草莓汁样品，而在去梗和带梗发酵草莓酒中只有19种和18种，芳樟醇和异戊醇为主成分1的主要香气物质，芳樟醇在草莓汁样品中含量最高，为15.57%，异戊醇在带梗发酵草莓酒中含量最高，为63.12%，且未在草莓汁样品中检出；第2主成分有22种，有16种物质来自去梗发酵草莓酒中，11种物质来自带梗发酵草莓酒中，而草莓汁样品中只有7种，辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯和乙酸异戊酯为主成分2的主要香气成分，在去梗发酵草莓酒中含量最高，为49.12%，而在带梗发酵草莓酒中只占5.86%，且未在草莓汁样品中检出。由此可以推出，第1主成分主要由草莓香和醇香共同组成，第2主成分主要为发酵香，其主成分的分布见图2。

表4 成分矩阵Table 4 Component matrix

从图2可以看出，3种样品得到了较好的区分，草莓汁主要分布于主成分1的正半轴，去梗发酵草莓酒主要分布于主成分2的正半轴，带梗发酵草莓酒主要分布于主成分1和主成分2的负半轴。具体来说，草莓汁位于第一象限，与芳樟醇、红没药醇、正己醇、肉桂酸乙酯、己酸甲酯、乙二醇二丁酸酯、丁酸甲酯、乙酸己酯靠近，是草莓汁的主要香气成分，具有甜橙、梨、香蕉、葡萄、玫瑰花、紫丁香等香气。去梗发酵草莓酒位于第二象限，与辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯、正己酸乙酯靠近，辛酸乙酯具有菠萝、梨和花香[23]，癸酸乙酯和月桂酸乙酯具有花香、果香和脂肪香味，正己酸乙酯、乙酸苯乙酯和乙酸异戊酯具有水果香、玫瑰和茉莉花香[26]。带梗发酵草莓酒位于第三象限，与异戊醇、苯乙醇、α-松油醇靠近，它们给酒体带来杂醇、苦杏仁和辛辣味。

图2 草莓汁及草莓酒香气化合物主成分样品 分布图和因子载荷图Fig.2 PCA distribution and loading plot of aroma components in strawberry juice and strawberry wines

2.4 感官评价

由表5可知，去梗发酵草莓酒感官评分最高，为(88.62±1.37)分，口感和香气均优于带梗发酵草莓酒。在外观方面，跟草莓汁相比，2种草莓酒的颜色均变浅，去梗发酵草莓酒酒体澄清透亮有光泽，而带梗发酵草莓酒酒体澄清但没有光泽。在口感方面，去梗发酵草莓酒酒体轻盈、口感清爽、酸涩适中、结构感强，而带梗发酵草莓酒总酸和酚类物质含量较高，酒体饱满、口感略粗糙、生青感较重、有苦涩味。研究发现，总酸赋予果酒骨架感和结构感，一般酸度为6.5～8.5 g/L时最为适宜，当酸度>8.5 g/L时，果酒会产生苦涩味，而<6.5 g/L时，口感较淡、酒体较薄[27-28]。在香气方面，去梗发酵草莓酒果香细腻优雅，草莓香气突出，具有较好的典型性，而带梗发酵草莓酒醇香浓郁，草莓香气明显，花香和果香较为平淡。

表5 草莓酒的感官评分Table 5 Sensory scores of strawberry wines

3 结论

本实验对2种不同原料酿造的草莓酒进行比较，发现两者理化指标、香气成分和感官品质有显著影响。2种草莓酒的理化指标均符合国标要求，带梗发酵草莓酒中的总酸和总酚含量较高且差异显著。草莓酒中共检测出40种香气化合物，其中共有成分24种，酯类物质在去梗发酵草莓酒中含量最高，为65.35%，是其主要香气成分；醇类物质在带梗发酵草莓酒中含量最高，为68.80%，是其主要香气成分。为了更准确地确定草莓酒中的关键香气化合物，有必要采用外标法对草莓酒的香气成分进行准确定量，计算气味活度值，并结合气相色谱-嗅味计或电子鼻等气味分析仪进一步论证。主成分分析表明，2种不同原料酿造的草莓酒香气风格差异区分明显，辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸异戊酯和正己酸乙酯是去梗发酵草莓酒的主要香气成分；异戊醇和苯乙醇是带梗发酵草莓酒的主要香气成分。去梗发酵草莓酒，酯类物质含量较高，以草莓香和果香为主，酒体轻盈、口感清爽，而带梗发酵草莓酒，总酸和总酚含量较高，香气复杂、酒体略粗糙、有苦涩味。在相同的发酵条件下，去梗发酵更加适合高品质草莓酒的酿造。