枇杷抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性部位的筛选及其酶动力学

魏爱红，李晓虹，曾煌,，梁淑荷，林展雯，庄远杯,，张声源,*

1(广东省山区特色农业资源保护与精准利用重点实验室(嘉应学院)，广东 梅州， 514015) 2(嘉应学院 医学院客家药用生物资源研究所，广东 梅州，514031) 3(嘉应学院 医学院分子生物学中心实验室，广东 梅州，514031)

据国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation，IDF)第10版数据显示，2021年全球20～79岁的成年糖尿病患者达5.37亿，预计到2030年将增至6.43亿，到2045年将增至7.83亿，中国糖尿病患者居世界首位[1]。持续性高血糖常导致糖尿病心脑血管病变、糖尿病神经病变、糖尿病肾病等并发症，严重危害人体健康[2]。

α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶是降低餐后血糖的重要靶点，作用于该靶点的阿卡波糖等临床运用制剂在中国糖尿病药物市场占据主导地位，仅次于胰岛素类[3]。但阿卡波糖对α-淀粉酶的过度抑制是其副作用产生的因素之一[4]。中草药具有多成分、多靶点协调作用的特点，在治疗消渴疾病的运用历史悠久，是现代降血糖先导化合物挖掘的重要来源，从中药材中挖掘更为安全、低毒、有效的天然α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂在降血糖食品药品的开发具有重要的意义。

枇杷[Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.]为蔷薇科枇杷属常绿小乔木，食用药用历史悠久，枇杷叶已收录于《中国药典》，枇杷花在2019年被批准为新食品原料，而果肉则作为水果食用，表明枇杷资源具有良好的药用食用基础，作为大健康食品药品的开发，具有更高的安全性[5]。

枇杷果肉、茎、花、叶、根、种子均可供药用，具有降逆和胃、化痰止咳、止泻功效，主治肺热咳喘、呕吐、烦渴等症状[6]，现已有枇杷叶膏、枇杷止咳颗粒等多种制剂应用于临床[7]。现代药理研究显示，枇杷主要含三萜、黄酮、酚类等化学成分，具有镇咳祛痰、降血糖、抗氧化、降血脂、抗菌消炎等药理作用[8-12]。枇杷降血糖药理活性显著，作为降血糖药用资源的开发具有广泛前景。关于枇杷降血糖的研究主要集中于枇杷叶和枇杷花，枇杷不同药物部位(根、茎、种子、叶、果肉、花)对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性差异的研究未见报道。

本文以枇杷果肉、茎、花、叶、根、种子的95%乙醇提取物为研究对象，测定枇杷不同药用部位对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制能力，明确活性部位，并进一步探究活性部位醇提取物及其主要组分总黄酮的酶促反应特征，为枇杷资源在降血糖功能食品药品的开发和高效利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枇杷于2020年7月采自广东省梅州市梅江区，经嘉应学院医学院客家药用生物资源研究所张声源副教授鉴定为蔷薇科(Rosaceae)枇杷属(Eriobotrya)枇杷[Eriobotryajaponica(Thunb.)Lindl.]。对硝基苯酚(p-nitrophenol，pNP)、对-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside，pNPG)，上海源叶生物科技有限公司；α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、牛血清白蛋白，Sigma有限公司；阿卡波糖，德国拜耳有限公司；可溶性淀粉，天津市大茂化学试剂厂；NaOH，上海麦克林生化科技有限公司；KH2PO4、K2HPO4，阿拉丁有限公司。

1.2 仪器和设备

SPARK酶标仪，TECAN公司；FA2004电子分析天平，德国赛多利斯有限公司；N-1100V旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；MING-CHE 24UV超纯水机，法国Merck Millipore公司；PB-21型 pH计，北京赛多利斯科学仪器有限公司；DHP-9052电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 样品的制备

枇杷果肉、茎、花、叶、根、种子，晒干，粉碎，按料液比1∶3(g∶mL)加入95%乙醇超声波提取3次(30 min、35 ℃、100 Hz、200 W)，静置24 h，用8层纱布过滤，合并提取液，浓缩得到枇杷根醇提物(提取率10.09%)、枇杷茎醇提物(提取率4.64%)、枇杷叶醇提物(提取率7.34%)、枇杷花醇提物(提取率6.21%)、枇杷果肉醇提物(提取率43.90%)、枇杷种子醇提物(提取率7.93%)，保存备用[13]。

枇杷花总黄酮的提取及纯化：称取枇杷花粉末200 g，依照1∶20 (g∶mL)的料液比，加入体积分数为60%的乙醇，超声波辅助浸提3次(250 W、60 ℃、40 min)，抽滤，合并滤液，4 ℃、4 000 r/min离心5 min，取上清液，浓缩干燥得枇杷花黄酮粗提物32.04 g，提取率16.02%，总黄酮含量以芦丁当量，即1 g干样品中黄酮类化合物相当于芦丁的质量(mg)，以rutin mg/g表示，含量为(44.46±1.34) rutin mg/g。准确配制6 g/L的枇杷花黄酮粗提物溶液，加至AB-8大孔树脂层析柱，4 h的静置吸附时间，先用蒸馏水洗去杂质，洗脱到滴出液无色，再用体积分数为50%的乙醇溶液洗脱，洗脱速率为2 BV/h，洗脱体积为3 BV，收集洗脱片段，减压浓缩干燥得精制枇杷花总黄酮，含量为(73.95±1.96) rutin mg/g[14-15]。

1.4 α-葡萄糖苷酶的抑制活性

采用微孔板法测定[16]，在96孔微孔板上加入110 μL PBS(pH 6.8，67 mmol/L)，10 μL样品溶液，20 μL 0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶，振荡混匀，37 ℃恒温孵育15 min，加入20 μL 4.0 mmol/LpNPG，混匀，37 ℃恒温反应15 min，于405 nm测吸光度，平行3次。以阿卡波糖为阳性对照，按照公式(1)计算抑制率。

(1)

式中：Ac,PBS代替样品的反应体系吸光度；Ab,PBS代替样品和酶的反应体系吸光度；AS,样品组的反应体系吸光度；Ad,PBS代替酶的反应体系吸光度。

1.5 α-淀粉酶的抑制活性

采用微孔板法测定[17]，依次加入样品溶液120 μL，120 μL 10 U/mL α-淀粉酶溶液，振荡混匀，加入120 μL已于37 ℃预温5 min的10 g/L可溶性淀粉溶液，混匀，37 ℃反应15 min，立即加入200 μL DNS显色，沸水浴5 min，冰水冷浴5 min，加入1 040 μL PBS至1 600 μL，于540 nm测定吸光度，平行3次。以阿卡波糖为阳性对照，按照公式(1)计算抑制率。

1.6 对α-葡萄糖苷酶抑制动力学试验

参考文献[18-19]，在pNPG浓度为4.0 mmol/L，在3组质量浓度下(枇杷花醇提取物为0、5、10 g/L；枇杷花总黄酮为0、0.026 1、0.052 2 g/mL)，分别测定不同α-葡萄糖苷酶活力时的酶促反应初速度，以酶活力(U/mL)为横坐标，反应初速度V0[μmol/(L·min)]为纵坐标作图，判断可逆或不可逆抑制类型。

固定α-葡萄糖苷酶活力为0.1 U/mL，在3组质量浓度下(枇杷花醇提取物为0、5、10 g/L；枇杷花总黄酮为0、0.026 1、0.052 2 g/mL)，测定不同pNPG浓度反应体系的反应速率，横坐标为pNPG浓度的倒数(1/[S])，纵坐标为反应初速度的倒数(1/V0)绘制Lineweaver-Burk 曲线，判断其是竞争性抑制、非竞争性抑制抑或反竞争性抑制类型。

1.7 对α-淀粉酶抑制动力学试验

参考文献[20]的方法，在10 g/L可溶性淀粉溶液，在3组质量浓度下(枇杷根为0、1.5、3 g/L；枇杷花总黄酮为0、0.78、1.57 g/L)，分别测定不同α-淀粉酶活力反应体系下的反应初速率，以酶活力为横坐标、反应初速率mol/(L·min)为纵坐标作图，判断其可逆或不可逆抑制类型。

固定α-淀粉酶活力10 U/mL，在3组质量浓度下(枇杷根为0、1.5、3 g/L；枇杷花总黄酮为0、0.78、1.57 g/L)，测定其在不同淀粉质量浓度(0.312、0.625、1.25、2.5、5、10 g/L)反应体系下的反应初速率，以底物质量浓度的倒数(1/[S])为横坐标、反应初速率的倒数(1/V0)为纵坐标绘制Lineweaver-Burk曲线，判断其是竞争性抑制、非竞争性抑制抑或反竞争性抑制类型。

1.8 统计学处理方法

实验重复3次，通过Origin 8.5软件进行数据处理并作图，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性

由图1可知，枇杷不同药用部位醇提取物均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，在一定质量浓度范围内，抑制率随质量浓度的增大而增强，呈现一定的量效关系。

图1 样品对α-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig.1 The α-glucosidase inhibition of sample

枇杷不同药用部位和阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制活性强弱依次为：阿卡波糖>枇杷花>枇杷茎>枇杷根>枇杷叶>枇杷果肉>枇杷种子，半抑制浓度(half inhibitory concentration，IC50)值分别为：阿卡波糖(2.46±0.16)g/L，枇杷花(4.65±0.35)g/L，枇杷茎(6.40±0.74)g/L，枇杷根(7.27±0.64)g/L，枇杷叶(15.07±1.04)g/L，枇杷果肉(120.06±2.33)g/L，枇杷种子(179.20±2.95)g/L。枇杷花对α-葡萄糖苷酶的抑制效果与阿卡波糖较为接近，且强于其他药用部位。我国枇杷花资源丰富，食用药用历史悠久，据统计，我国枇杷栽种面积达11万hm2，为全球之最，但在疏花过程导致70%的枇杷花资源的浪费[21]。枇杷花可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂资源应用于降血糖功能食品的开发。

2.2 α-淀粉酶抑制活性

由图2可知，枇杷不同药用部位均具有α-淀粉酶抑制活性，在一定质量浓度范围内，抑制率随质量浓度的增大而增强，呈现一定的量效关系。枇杷不同药用部位和阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制活性强弱依次为：阿卡波糖>枇杷根>枇杷茎>枇杷花>枇杷叶>枇杷果肉>枇杷种子，IC50值分别为：阿卡波糖(0.11±0.06)g/L，枇杷根(1.51±0.24)g/L，枇杷茎(12.26±0.56)g/L，枇杷花(14.41±0.59)g/L，枇杷叶(30.30±1.12)g/L，枇杷果肉(48.81±1.53)g/L，枇杷种子(237.16±2.67)g/L。枇杷根对α-淀粉酶的抑制效果强于其他药用部位。枇杷不同药用部位对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性强弱的次序不同，可能与其不同药用部位的萜类、黄酮类成分含量差异有关，郑美瑜等[22]研究发现枇杷花黄酮含量显著高于叶和种子，曹红云[23]研究发现枇杷根总萜物质含量高于枇杷叶。故实验进一步探究枇杷花醇提取物对α-葡萄糖苷酶以及枇杷根醇提取物对α-淀粉酶抑制的酶促动力学特征。此外，对α-淀粉酶的过度抑制是导致胃肠胀不良反应主要因素之一，为此我们选取了α-葡萄糖苷酶抑制作用最强而对α-淀粉酶抑制作用较弱的枇杷花为原料，进一步探究枇杷花纯化后的总黄酮对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制作用及其酶动力学特征。

图2 样品对α-淀粉酶的抑制效果Fig.2 The α-amylase inhibition of sample

2.3 枇杷花醇提取物对酶抑制类型的确定

2.3.1 枇杷花醇提取物对α-葡萄糖苷酶抑制类型

由图3-a可知，当枇杷花醇提取物质量浓度为0 g/L，即未加抑制剂组，得到的反应速率直线经过原点；当枇杷花醇提取物质量浓度为5、10 g/L时，所得的直线均近似通过原点，且为10 g/L的直线的斜率低于5 g/L的直线的斜率，由此可得枇杷花醇提取物对α-葡萄糖苷酶为可逆性抑制。由图3-b可知，当枇杷花醇提取物质量浓度为0、5、10 g/L，反应速率相对无抑制剂组明显下降，随着枇杷花醇提取物质量浓度的增大，反应速率越慢，且3条直线近似交于x轴的负半轴于同一点，即Km值不变，为2.60 mmol/L，但Vmax值变小，由此可得枇杷花醇提取物对α-葡萄糖苷酶为非竞争性抑制类型。该抑制类型与谢子玉[24]对枇杷花中槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷抑制α-葡萄糖苷酶类型不同，由此推测枇杷花95%乙醇提取物中具有其他潜在成分对α-葡萄糖苷酶抑制活性及其结合方式起着重要作用，应进一步探究其潜在的活性成分及其成分间协同降血糖作用效果。

a-可逆、不可逆抑制类型的确定；b-竞争性、非竞争性、 反竞争性和混合型抑制类型的确定图3 枇杷花醇提取物对α-葡萄糖苷酶抑制类型的确定Fig.3 Determination of α-glucosidase inhibitory type of E.japonica flower ethanol extract

2.3.2 枇杷根醇提取物对α-淀粉酶抑制类型

由图4-a可知，当枇杷根质量浓度为0 g/L，即未加抑制剂组，得到一条经过原点的反应速率直线；当枇杷花质量浓度为1.5、3 g/L时，所得的直线均近似通过原点，且3 g/L的直线的斜率低于1.5 g/L的直线的斜率，由此可得枇杷根对α-淀粉酶为可逆性抑制。由图4-b可知，当枇杷根质量浓度为0、1.5、3 g/L的3条线性拟合直线经过y轴的正半轴于同一点，即Vmax值不变，为5.90 mol/(L·min)，且随着枇杷根质量浓度的增大，反应速率加快，由此可得枇杷根对α-淀粉酶属于竞争性抑制类型，表明枇杷根95%乙醇提取物与淀粉竞争α-淀粉酶结合位点，从而达到延缓淀粉水解。该抑制类型与阳性对照阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制类型不同[25]，是一种潜在的新型α-淀粉酶抑制剂筛选资源。

a-可逆、不可逆抑制类型的确定；b-竞争性、非竞争性、 反竞争性和混合型抑制类型的确定图4 枇杷根醇提取物对α-淀粉抑制类型的确定Fig.4 Determination of α-amylase inhibitory type of E.japonica root ethanol extract

2.4 枇杷花总黄酮对酶抑制活性及抑制类型的确定

2.4.1 枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性

由表1可知，枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶均具有良好的抑制活性，对α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值为(0.017 4±0.003 5) g/mL，低于枇杷花醇提取物的(4.65±0.35)g/L；对α-淀粉酶的抑制活性的IC50值为(1.57±0.03)g/L，低于枇杷花醇提取物的(14.41±0.59)g/L，即枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制活性显著强于枇杷花醇提取物，表明经过超声波提取和大孔树脂纯化能有效富集枇杷花中抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的活性组分。

2.4.2 枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制类型

由图5-a可知，当枇杷花总黄酮质量浓度为0、0.026 1、0.052 2 g/L时，3组反应速率直线近似经过原点，由此可得枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶为可逆性抑制。由图5-b可知，枇杷花总黄酮质量浓度为0、0.026 1、0.052 2 g/L的3组速率直线相交于横轴负半轴的同一点，且Km值不变，为1.825 mmol/L，Vmax值随着质量浓度的增大而减小，可判断为非竞争性抑制类型。结合2.3.1结果可知，枇杷花总黄酮与枇杷花醇提取物对α-葡萄糖苷酶抑制类型一致，均为可逆非竞争性抑制类型。

表1 枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性Table 1 The α-glucosidase and α-amylase inhibition of total flavonoids from E.japonica flower

a-可逆、不可逆抑制类型的确定；b-竞争性、非竞争性、 反竞争性和混合型抑制类型的确定图5 枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制类型的确定Fig.5 Determination of α-glucosidase inhibitory type of total flavonoids from E.japonica flower

2.4.3 枇杷花总黄酮对α-淀粉酶抑制类型

由图6-a可知，当枇杷花总黄酮质量浓度为0、0.78、1.57 g/L时，3组反应速率直线近似经过原点，由此可得枇杷花总黄酮对α-淀粉酶为可逆性抑制。由图6-b可知，枇杷花总黄酮质量浓度为0、0.78、1.57 g/L的3组速率直线相交于横轴负半轴的同一点，且Km值不变，为1.536 9 g/L，Vmax值随着质量浓度的增大而减小，可判断为非竞争性抑制类型。

a-可逆、不可逆抑制类型的确定；b-竞争性、非竞争性、 反竞争性和混合型抑制类型的确定图6 枇杷花总黄酮对α-淀粉酶抑制类型的确定Fig.6 Determination of α-amylase inhibitory type of total flavonoids from E.japonica flower

3 结论

本文系统比较研究了枇杷根、茎、叶、花、果肉、种子6个药用部位95%乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性并对其最强活性部位的酶促反应动力学进行了分析。结果显示，在枇杷不同药用部位中，枇杷根醇提取物具有最强的α-淀粉酶抑制活性，IC50值为(1.51±0.24)g/L，对α-淀粉酶为可逆竞争性抑制类型，Vmax=5.90 mol/(L·min)；枇杷花醇提取物具有最强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50值为(4.65±0.35)g/L，对α-葡萄糖苷酶为可逆非竞争性抑制类型，Km=2.60 mmol/L。枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性IC50分别为(0.017 4±0.003 5)、(1.57±0.03)g/L，强于枇杷花醇提取物，且对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制类型与枇杷花醇提取物一致，均为可逆非竞争性抑制类型。明确了枇杷不同药用部位对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性差异，及其最强活性部位醇提取物和枇杷花总黄酮对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的结合方式。研究结果为枇杷作为α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂资源及其降血糖功能食品的开发利用提供了科学依据。