子陵吻虾虎鱼胚胎发育初步观察

赵长华

（彭水县农业技术推广中心，重庆彭水 409600）

子陵吻虾虎鱼（Rhinogobius giurinus）为鲈形目（Perciformes）虾虎鱼亚目（Gobioidei）虾虎鱼亚科（Gobiinae）吻虾虎鱼属（Rhinogobius）鱼类[1]，在中国分布广泛，除了西藏和新疆，其他各大水系都有分布[2]。成年子陵吻虾虎鱼体长30～100 mm，鳃盖上方具有3 个感觉管孔；峡部较宽，鳃盖膜与峡部相连。多栖息在隐蔽的水体环境中，尤其喜欢栖息在水草丰富的水域[3-4]。因其具有体型较小、颜色艳丽、性情活跃等特点，近年来逐渐成为一种备受人们喜爱的原生观赏鱼品种。目前，已有关于子陵吻虾虎鱼形态学特征、生物学特性及群体遗传多样性的研究报道[3,5]，对胚胎发育的研究尚未见诸报道。本研究对子陵吻虾虎鱼的胚胎发育进行了详细的形态学观察和数据测量，并对发育过程各个阶段进行显微拍照记录，旨在为子陵吻虾虎鱼的人工繁育积累资料，也为其他鱼类等有脊椎动物的胚胎发育研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 亲鱼选择

实验所用亲鱼来自西南大学水产实训基地观赏鱼繁育研究室，挑选性成熟个体进行两两配对，养于水深30 cm、大小为1 100 mm×500 mm×500 mm 的玻璃水族箱中，在水族箱中布置假山和水草。

1.2 试验方法

在水族箱中使用恒温加热棒进行控温，每7 d换水1 次。保持pH 值稳定在6.5～7.5，水温保持在(27± 0.5)℃，添加过滤器，避免排泄物污染水质。早晚各投喂1 次人工配合饲料，并适量投喂鱼虫和水蚯蚓等活饵料。在水族箱中放置用来繁殖鱼类的产卵筒，让子陵吻虾虎鱼自行产卵受精。将受精卵连同产卵筒一起从水族箱中拿出，放入孵化缸内，加入适量甲基蓝防止受精卵坏死[6]。胚胎发育前期每隔20 min从孵化缸中选取颗粒饱满的受精卵，在解剖镜下对受精卵进行活体观察，在胚胎发育到囊胚期之后，每隔40 min 观察1 次。观察的同时拍照记录并分析形态特征，同时记下水温和发育到各个阶段的大致时间，拍照记录后需立即将用于观察的受精卵放回水族箱中，以防止温差过大导致受精卵死亡。

2 结果与分析

子陵吻虾虎鱼胚胎发育各阶段的形态和描述见图版I和表1。

表1 子陵吻虾虎鱼胚胎发育描述

图版Ⅰ子陵吻虾虎鱼胚胎发育形态

（续）图版Ⅰ子陵吻虾虎鱼胚胎发育形态

2.1 卵的形态

受精卵为淡黄色，呈球形，光滑的卵膜质感很薄，且富有弹性。子陵吻虾虎鱼属黏性卵，在受精卵动物极一端带有黏液，黏液让受精卵能够吸附在产卵基上。受精卵遇水后吸水膨胀，吸水饱和后受精卵的纵轴为1.02～1.14 mm，横轴为0.75～0.79 mm。

2.2 胚盘形成阶段

在水温27 ℃的孵化环境下，卵子在受精后0.83 h，卵周隙在受精卵内出现，细胞质开始向动物极移动集中，逐渐隆起，随后形成胚盘（见表1、图1）。

2.3 卵裂阶段

孵化环境稳定在27 ℃上下，第一次卵裂发生在卵子受精后1.50 h 左右。第一次卵裂为径向卵裂，第一次卵裂结束后，得到2 个形态完全相同的细胞，受精卵进入2 细胞期（见表1、图2）。随着时间推移，受精卵内细胞继续分裂，细胞数按4、8、16、32……成倍增长，在受精后1.83 h 左右进入4 细胞期（见表1、图3），2.25 h 进入8 细胞期（见表1、图4）。其中第2～4 次卵裂为经裂，在显微镜下观察，可以观察到每次卵裂沟和上次的卵裂沟垂直，第5 次之后的卵裂则变化为纬裂。随着一次次卵裂的发生，分裂得到的细胞体积越变越小，且卵裂细胞数量多到难以计数，在受精后5.50 h 受精卵进入多细胞期（见表1、图5），此时的胚胎像一颗桑葚，所以又称为桑葚胚。

2.4 囊胚阶段

受精后6.50 h，因为卵裂的进行，胚盘细胞不断地分裂，细胞数量增多，体积越分越小，细胞界限变得模糊，在显微镜下很难观测到，囊胚隆起高度约为受精卵长轴的1/4，高举在卵黄囊上，此时胚盘由被膜层和深膜层细胞组成，在卵黄和深层细胞之间的空间则被称为囊胚腔，此时受精卵进入囊胚早期（见表1、图6）。细胞继续分裂，受精后10.37 h，随着细胞变得密集，囊胚高度不断慢慢下降，胚胎进入囊胚中期（见表1、图7）。受精后约14.50 h，胚胎逐渐下包，囊胚由厚变扁平，此时胚胎进入囊胚晚期（见表1、图8），胚层开始向下移动。

2.5 原肠阶段

胚胎进一步下包，受精后16.50 h左右，受精卵内胚环形成。同时，胚盘边缘的囊胚深层细胞开始向内卷，上、下胚层细胞开始向背部集中、伸展，胚环的一定部位出现三角形隆起，形成胚盾的雏形。受精后19.00 h 左右，胚层下包达到卵黄囊的1/2 处，进入原肠早期（见表1、图9），于是原肠作用便开始了。受精后20.50 h，胚层下包至卵黄囊的2/3 处，胚盾明显拉长，胚胎进入原肠中期（见表1、图10）。受精后21.42 h，胚层下包至卵黄囊的3/4 处，胚胎进入原肠晚期（见表1、图11），此时显微镜中可以观察到神经板的雏形。因为胚环的不断下包，囊胚腔渐渐在视野中消失，等到胚环下包接近合围时出现胚体雏形，胚盾前端发育膨胀，出现脑原基。

2.6 神经胚阶段

受精后24.50 h，胚环进一步下包，囊胚层细胞下包到了卵黄囊的底部。同时植物极区域的内胚层渐渐隐没于胚内，胚孔外有一部分卵黄囊露出，这部分卵黄囊形成卵黄栓，胚胎进入神经胚期（见表1、图12），胚盾的神经外胚层不断增殖加厚发育形成神经板，随后神经板下陷形成神经沟。神经物质在被膜层下集中，一条实心的细胞索诞生了，随后胚胎继续发育，细胞索发育成中空管，前端分出前脑泡、中脑泡、后脑泡。受精26.67 h后，胚层继续收缩合拢，完全包围住全部卵黄囊，胚孔完全封闭（见表1、图13）。

2.7 器官形成阶段

受精后29.50 h，胚胎上出现3～4 对肌节（见表1、图14）。受精后30.17 h，从前脑泡两侧收缩形成2个膨大椭圆状的眼囊，前脑两侧形成2 个肾状突起，形成眼基（见表1、图15），同时脊索开始出现，呈柱状，可以分辨胚胎的头部和尾部。胚胎的脑部继续发育膨大，但是因未分化完全，不易辨别脑的各个部位。受精后33.33 h，眼囊的前部出现嗅囊（见表1、图16），在受精35 h 后，在眼囊的后方形成一对泡状结构，慢慢发育成听囊（见表1、图17），同时胚胎头部开始隆起，随后逐渐脱离卵黄。受精后36.33 h，胚胎的尾部发育出椭圆形囊状结构，之后发育形成尾芽（见表1、图18），随后胚体尾芽逐渐脱离卵黄囊。受精后33.17 h，肌肉效应开始发生，胚体开始做间断性扭动抽搐（见表1、图19～图20）。受精后35.33 h，胚胎心脏分化出室并开始有规律地跳动，但是频率非常低（见表1、图21）。受精后40.33 h，胚体内出现体液循环，血管渐渐舒展开来，血液在血管中流淌，血细胞通过增殖变多，血液由透明变不透明，同时全身体液开始流动，心脏跳动频率加快（见表1、图22～图23）。受精后48.00 h，听囊里出现2 个黑点，表明耳石形成（见表1、图24）。

2.8 孵化出膜阶段

受精后50.33 h左右，卵膜慢慢变薄，胚体在卵膜内急剧地抽搐扭动，尾部快速拍打卵膜，多次拍打后尾部尖端刺破卵膜，其后仔鱼成功破膜而出（见表1、图25～图27），从第一次尾巴拍打卵膜开始到仔鱼大量孵化破膜而出大概需要1.50 h。刚出膜的仔鱼鳍尚未发育完全，只能在水中漂浮，胸鳍原基尚未发育，背鳍膜出现在头后，尾鳍膜位于卵黄囊后。仔鱼体色透明，体内血液流动，在腹部形成1 条黑色纹路（见表1、图28）。仔鱼腹部带有卵黄囊，囊前端膨大，形似鸡蛋，头部紧贴，口裂不明显，因为消化系统未完全发育，仔鱼无法从外部摄食获取营养，靠黄囊内部营养物质供能。初孵化的仔鱼平均体长约5 mm。卵黄囊随着内部储存的营养物质逐渐消耗而变小，大概在出膜1 d 后明显缩小，口裂明显（见表1、图29）。出膜2 d 后，卵黄囊基本消失，此时仔鱼消化系统基本上发育完全，能够自由游动。

胚胎发育各阶段历时和所需积温见表2。

表2 子陵吻虾虎鱼胚胎发育各阶段和所需积温

3 结论与讨论

3.1 子陵吻虾虎鱼和其他淡水鱼胚胎发育的异同

子陵吻虾虎鱼的胚胎发育各个阶段形态特征与暹罗斗鱼[6]、银鲈[7]等淡水鱼相似。笔者观察发现，子陵吻虾虎鱼的色素是在仔鱼出膜2 d 后形成的，色素堆积较少，这不同于圆尾斗鱼和血鹦鹉（在器官形成期生成色素细胞）。子陵吻虾虎鱼出膜前，身体急剧扭动，靠尾部拍打卵膜，尾部先破膜而出，这与大鳞副鳅仔鱼破膜方式相同，与银鲈和达氏鲟等其他淡水鱼靠头部破膜出膜方式不同。子陵吻虾虎鱼仔鱼出膜后4 d开口摄食饲料，这与其他淡水鱼基本相同。

3.2 孵化水体的pH 值和温度对子陵吻虾虎鱼受精卵孵化胚胎的影响

本实验在子陵吻虾虎鱼受精卵的孵化过程中控制了pH 值和温度，保证孵化时pH 值和温度仅在一定范围内浮动。经过查证资料可以了解到，不同种类鱼的胚胎发育最适pH 值不同。因胚胎还在发育阶段，大部分调节机制尚未建立成功，酸碱调节机制便是其一。极端的pH 值会破坏尚未能完全起作用的酸碱调节机制，通过改变胚胎发育过程中酶与底物结合或改变酶的构象来影响酶的活性，从而阻止胚胎正常发育。孙艳秋等在对多纹钱蝶鱼胚胎发育的研究中发现，低pH 值会导致胚胎畸形，其中大多数畸形个体表现为腹部明显呈膨大状，背腹方向弯体；少数的畸形个体出现小头症状[8]。高pH 值则会在胚胎发育期间致死，仔鱼无法出膜。极端的pH 值环境会引起卵膜软化，卵膜向内塌陷并失去弹性，导致受精卵卵膜极易破碎，仔鱼无法正常孵化。同时pH 值也会对鱼的性别决定过程产生干扰，现知会导致海水鱼类种群的性别比例失调，从而对鱼类繁殖的进行产生影响。所以在鱼卵的孵化过程控制pH 值甚是重要。刘艳超等[9]在对拉萨裸裂尻鱼胚胎发育的研究中对调节温度进行多次实验，发现适当提高孵化温度可以减少受精卵的孵化时间，加快孵化速率，但是过高的孵化温度会导致胚胎致畸致死。吴青等提出，对齐口裂腹鱼适当提高受精卵孵化温度有利于降低管理成本和孵化风险、提高孵化率及减少患病几率[10]。

3.3 子陵吻虾虎鱼循环系统的发育和功能

循环系统是鱼的胚胎发育中较早出现的系统，其功能是给胚胎提供氧气和发育必需的营养物质。循环系统可以将营养物质与氧气从卵黄囊运输至胚胎体内供胚胎吸收使用，因此对卵黄囊上血液循环的研究很重要。Thomas 等认为卵黄囊上的血液循环系统仅是用于运输卵黄囊上的卵黄物质[11]，而不能进行气体交换。然而，Kovac 发现部分鱼的卵黄囊有着更加复杂的结构[12]，这是为了使气体交换更加方便地进行。通过对子陵吻虾虎鱼的胚胎发育观察可知，仔鱼在出膜前鳃弓就已经出现了，并且分布毛细血管，有循环系统，所以卵黄囊应该只是为胚胎提供营养物质。

3.4 子陵吻虾虎鱼仔鱼破膜后残留的卵膜对水质的影响

子陵吻虾虎鱼的卵属黏性卵，仔鱼破膜孵化后卵膜残留在产卵基质上，膜表面富含蛋白质和营养物质，如果不及时处理，会腐烂、滋生细菌，残留的卵膜可能生长出水霉，败坏水质，继而污染其余尚未孵化的受精卵。据周玉等提出，在神仙鱼胚胎和仔鱼发育过程中，确定不再有仔鱼孵化时，要及时将产卵板取出，将脱落的受精卵膜和死卵及时捞出，避免水质被破坏[13]，该法可供参照借鉴。