静态顶空-气相色谱-质谱法分析不同产地大红袍花椒中挥发性成分

赵燕飞,卫博慧,王芮东

(运城学院 理科实验中心，运城 044000)

花椒作为调料使用时，可为菜品增添浓郁味道，增加食欲[1];作为药物使用时，具有杀菌杀虫、护肝开胃、驱寒暖胃、降压消肿等功效。大红袍是我国分布范围较广、栽培面积最大的优良花椒品种，挥发性成分是其中重要的功效成分。因受品种、气侯、地区的影响，成熟大红袍花椒中挥发性成分具有一定差异[2-11]。文献[12]采用常温溶剂萃取法和同时蒸馏萃取法提取花椒中的挥发性成分，并鉴定出123种成分。文献[13]采用水蒸气蒸馏法、无溶剂微波蒸馏法和超声辅助溶剂萃取法提取韩城大红袍花椒挥发油，并鉴定出62种成分。文献[14]采用油浸法、水蒸气蒸馏法及超临界二氧化碳萃取法提取花椒中挥发性成分，并分别鉴定出65，100，82种成分，贡献最大的成分分别为月桂烯、芳樟醇以及桉树醇和芳樟醇。在传统挥发性成分提取方法中，溶剂萃取法只能提取与溶剂极性相似的成分，蒸馏萃取法和超临界二氧化碳萃取法在高温时会损失相对分子质量小的易挥发性成分，超声辅助萃取法和油浸法的提取率较低[15-17]。因此，开发减少前处理造成成分差异的方法很有必要。

静态顶空法是将未溶剂化的样品直接放入顶空瓶内，通过加热提取样品中的挥发性气体进行分析。该方法具有用量小、直接进样、方便快捷、被分析挥发性成分损失少等优点[18-20]，最大程度避免了有机溶剂纯度、基质成分干扰以及样品前处理造成的易挥发成分损失，但目前尚未发现该方法在花椒挥发性成分分析中的应用。本工作采用静态顶空法提取3个省份9 个产地大红袍花椒样品中的挥发性成分，采用气相色谱-质谱法检测，采用主成分分析法寻找区分各产地样品的差异性物质，以期为花椒的综合利用提供方法参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪;7697AHeadspace-Sampler型顶空自动进样器;FA124 型电子天平。

花椒购于当地市场，产地分别为四川省雅安市汉源县、广元市青川县、自贡市，河南省驻马店市、洛阳市、郑州市，山西省临汾市乡宁县、阳泉市盂县、运城市芮城县，经运城学院生命科学系植物学专业王玲丽副教授鉴定，均为大红袍花椒(Zanthoxylum bungeanum)。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 顶空条件

加热箱温度100 ℃;平衡时间30 min;定量环温度110 ℃。

1.2.2 色谱条件

DB-17MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25μm)。柱升温程序:初始温度为40 ℃，保持2 min;以5 ℃·min－1速率升温至150 ℃，保持5 min;以6 ℃·min－1速率升温至230 ℃，保持10 min。进样量1 mL;不分流进样;进样口温度250 ℃;载气为氦气，流量1.0 mL·min－1。

1.2.3 质谱条件

电子轰击离子源;电子能量70 eV;离子源温度230 ℃，四极杆温度150℃;溶剂延迟时间5 min;增益系数1;扫描范围 质荷比(m/z)30～450。

1.3 试验方法

选取颗粒均一、无籽花椒颗粒，自然晾干后过40 目(孔径0.425 mm)筛网。分取1.0 g 置于20mL顶空瓶中，用卷边器封口，按照仪器工作条件进行测定。

1.4 数据处理

用仪器配置的NIST 2008谱库进行质谱检索，通过化合物保留时间和定性离子定性，对正反匹配度均大于800的成分予以保留。采用峰面积归一化法进行半定量分析，以相对含量表示。采用SPSS 26.0软件进行主成分分析。

2 结果与讨论

2.1 顶空条件的选择

顶空条件会直接影响挥发性成分的总峰面积和有效峰面积(正反匹配度均大于800成分的峰面积总和)，进而影响到各组分的相对含量。决定顶空条件的主要因素有加热箱温度、平衡时间、定量环温度等。

加热箱温度会影响分析物在顶空瓶内气相中的浓度水平。一般来说，升高温度会促进样品中成分挥发，但温度过高会导致某些组分分解或氧化。试验考察了加热箱温度分别为80，90，100，110℃时对挥发性成分总峰面积和有效峰面积的影响，结果见图1。

图1 加热箱温度对挥发性成分总峰面积和有效峰面积的影响Fig.1 Effects of heating box temperature on the total peak area and effective peak area of volatile components

由图1可知，加热箱温度为100 ℃时的挥发性成分总峰面积和有效峰面积明显高于80，90 ℃时的，在110℃时总峰面积和有效峰面积有所下降，因此试验选择的加热箱温度为100 ℃。

定量环可将挥发性成分从样品瓶中分离出来，为防止挥发性成分冷凝，定量环温度需高于加热箱温度。试验考察了定量环温度分别为110，120℃时对挥发性成分总峰面积和有效峰面积的影响，结果见图2。

图2 定量环温度对挥发性成分总峰面积和有效峰面积的影响Fig.2 Effects of quantitative ring temperature on the total peak area and effective peak area of volatile components

由图2可知，定量环温度为110 ℃时的挥发性成分总峰面积和有效峰面积高于120 ℃时的，因此试验选择的定量环温度为110 ℃。

试验考察了平衡时间分别为30，45，60 min时对挥发性成分总峰面积和有效峰面积的影响，结果见图3。由图3可知，平衡时间为30，60 min时挥发性成分总峰面积和有效峰面积大于45 min时的。考虑到仪器使用成本，试验选择的平衡时间为30 min。

图3 平衡时间对挥发性成分总峰面积和有效峰面积的影响Fig.3 Effects of equilibrium time on the total peak area and effective peak area of volatile components

2.2 挥发性成分分析

按照试验方法分析3个省份9个产地的大红袍花椒样品，经NIST 2008谱库匹配，共鉴别出120种挥发性成分，如表1所示，其中序号1～56对应烯烃类化合物，序号57～58对应芳香烃类化合物，序号59～68对应烷烃类化合物，序号69～92对应醇类化合物，序号93～99对应醛类化合物，序号100对应酚类化合物，序号101～112对应酮类化合物，序号113～120对应酯类化合物。

由表1可知，在120种挥发性成分中，9个产地的共有成分有12种，分别为柠檬烯、γ-松油烯、别罗勒烯、石竹烯、δ-杜松烯、(－)-α-依兰油烯、γ-依兰油烯等7种烯烃类化合物，芳樟醇、2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇等2 种醇类化合物，2-异丙基-5-甲基-3-环己烯-1-酮1种酮类化合物，乙酸松油酯、乙酸香叶酯等2种酯类化合物。在9个产地样品的12种共有成分中，青川县样品中柠檬烯相对含量最高(48.985%)，芮城县样品中γ-松油烯相对含量最高(23.140%)，乡宁县样品中别罗勒烯相对含量最高(4.548%)，郑州市样品中(－)-α-依兰油烯、δ-杜松烯相对含量最高(0.092%，0.121%)，自贡市样品中芳樟醇、乙酸香叶酯相对含量较高(11.149%，1.631%)，洛阳市样品中石竹烯、γ-依兰油烯、2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇、2-异丙基-5-甲基-3-环己烯-1-酮、乙酸松油酯相对含量最高(0.541%，0.067%，0.166%，2.594%，2.094%);9个产地样品中柠檬烯的相对含量均较高，其中青川县样品中的相对含量最高(48.985%)，洛阳市样品中的相对含量最低(9.646%)。同一省份不同产地样品中挥发性成分的种类和数量也明显不同。四川省样品中的共有成分有19种，存在于单一产地样品中的挥发性成分有35 种，如汉源县样品中(±)-β-水芹烯(12.221%，各产地最高)、青川县样品中4-甲基-1-(1-甲基乙基)-双环[3.1.0]十六烷-2-烯(11.098%，各产地最高)、自贡市样品中丁酸芳樟酯(22.323%，各产地最高)均没有出现在四川省另外两个产地的样品中;河南省样品中的共有成分有29种，存在于单一产地样品中的挥发性成分有34种，如驻马店市样品中的β-榄香烯(0.355%，各产地最高)、洛阳市样品中的α-侧柏烯(6.300%，各产地最高)、郑州市样品中的β-蒎烯(9.564%)均没有出现在河南省另外两个产地的样品中;山西省样品中的共有成分有28种，存在于单一产地样品中的挥发性成分有37种，如乡宁县样品中顺-3-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-醇(0.069%，各产地最高)、盂县样品中β-蒎烯(13.703%，各产地最高)、芮城县样品中桉叶油醇(14.692%)均没有出现在山西省另外两个产地的样品中。

表1 9个产地大红袍花椒样品中的挥发性成分Tab.1 Volatile components in Zanthoxylum bungeanum samples from the 9 regions

表1 (续)

表1 (续)

表1 (续)

对各产地样品中8类化合物相对含量的总量进行汇总，结果见表2。

表2 9个产地样品中8类化合物相对含量的总量Tab.2 Total relative contents of 8 kinds of compounds in samples from the 9 regions

由表2可知，青川县样品中烯烃类化合物相对含量总量最高(94.679%)，汉源县样品中烷烃类化合物相对含量总量最高(5.492%)，洛阳市样品中酮、醛类化合物相对含量总量最高(5.170%，0.704%)，驻马店市样品中醇类化合物相对含量总量最高(30.067%)，自贡市样品中酯类化合物相对含量总量最高(26.169%)，乡宁县样品中芳香烃类化合物相对含量总量最高(0.047%)，酚类化合物(2，3，5，6-四甲基苯酚)仅能在乡宁县样品中检测到(0.357%)。

图4为汉源县、青川县、自贡市、驻马店市、洛阳市、郑州市、乡宁县、盂县、芮城县样品的总离子流图。选取自贡市、洛阳市、乡宁县样品的总离子流色谱图分别做挥发性成分标识，如图5所示。

图4 9个产地样品的总离子流色谱图Fig.4 Total ion chromatograms of samples from the 9 regions

图5 自贡市、洛阳市、乡宁县样品的挥发性成分标识图Fig.5 Identification charts of volatile components of samples from Zigong，Luoyang and Xiangning

2.3 主成分分析

主成分分析也称主分量分析，旨在利用降维思想，把多个指标转化为少数几个综合指标，来反映原来指标中的信息。通过SPSS 26.0软件对挥发性成分进行主成分分析，结果显示，第一主成分的方差贡献率最大(52.558%)，第二主成分次之(18.839%)，累计方差贡献率达到71.397%。第一主成分主要的挥发性成分有柠檬烯、对甲-α-甲基苯乙烯、石竹烯、乙酸松油酯、2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇;第二主成分主要的挥发性成分有芳樟醇、乙酸香叶酯、α-异松油烯、别罗勒烯。第一主成分方差贡献率最大，其中2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇和乙酸松油酯对样品中挥发性成分的影响较大，可以作为区分不同产地花椒的差异性物质，对甲-α-甲基苯乙烯、石竹烯可作为辅助差异性物质参与产地鉴定。

本工作采用静态顶空-气相色谱-质谱法对3个省份9个产地的大红袍花椒样品中的挥发性成分进行分析，共检测出120种挥发性成分，其中共有成分有12种。对花椒中挥发性成分影响较大的成分有2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇、乙酸松油酯、对甲-α-甲基苯乙烯、柠檬烯、石竹烯等，其中2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇和乙酸松油酯可作为区分不同产地花椒的差异性物质。