亲水相互作用液相色谱法测定化妆品中肌肽的含量

唐毓萍,孙晓梅,王艳旗,闫志强,李慧良

(华熙生物科技股份有限公司上海研发中心，上海 200131)

肌肽是由β-丙氨酰与L-组氨酸残基构成的二肽，具有相对分子质量小，性质稳定、易吸收等优点。肌肽可以调节机体内酸碱度、螯合金属离子、抑制非酶糖基化，具有抗氧化性等生理活性[1-3]。肌肽可通过清除或抑制自由基阻止或缓解皮肤衰老，被广泛地应用于抗衰老化妆品中。不同浓度水平的肌肽对修复皮肤损伤、改善皮肤等功效方面有明显区别，如果过量使用则会导致皮肤过敏等副作用[4]，因此在化妆品研制过程中，需要控制肌肽的添加量。

肌肽的检测方法主要有电泳法[5]和高效液相色谱法(HPLC)[6-8]，其中HPLC 应用较多。文献[6]采用PrevailTMCarbohydrate ES色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)作固定 相，以甲醇-乙酸溶 液(pH 3.5)体系作流动相进行等度洗脱分离，在检测波长210 nm 处测定化妆品中肌肽的含量，但是肌肽在该色谱柱上的保留较弱;文献[7]采用邻苯二甲醛衍生肌肽，以附荧光检测器的HPLC 测定其含量;文献[8]则采用2，4-二硝基氟苯衍生肌肽，以附二极管阵列检测器(DAD)的HPLC 测定其含量。柱前衍生法虽然可以解决肌肽保留弱的问题，但是前处理过程比较繁琐。亲水相互作用液相色谱法(HILIC)[9]是一种用于分析强极性、可离解化合物的强有力的分析技术，所使用的亲水、极性固定相可从流动相中吸附水分子，在其表面形成“富水层”，分析物通过在固定相表面的“富水层”和流动相中的“有机溶剂层”间的亲水液液分配而滞留，从而达到色谱分离目的。化妆品基质比较复杂，肌肽添加量较少，为了降低复杂前处理带来的影响，试验以亲水相互作用色谱柱为固定相，以体积比60∶40的乙腈和乙酸盐缓冲溶液(用乙酸调节10 mmol·L－1乙酸铵溶液酸度至pH 3.5)的混合溶液为流动相进行等度洗脱，以附DAD 的HPLC 测定化妆品中肌肽的含量，该方法操作简单、色谱柱保留能力好、分离能力强，可为化妆品中肌肽的检测提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪，配DAD;KQ-300DE型超声波清洗器;IKA Vortex 2型涡旋混合器;ME 204型分析天平;MIlli-Q 型超纯水机。

标准储备溶液:10 g·L－1，取0.1 g(精确至0.000 1 g)L-肌肽标准品，用流动相溶解并定容至10 mL，摇匀备用。

标准溶液系列:取适量标准储备溶液，用流动相逐级稀释，配制成质量浓度分别为5，10，20，50，100，200 mg·L－1的标准溶液系列。

L-肌肽标准品的纯度为99%;乙腈、乙酸铵、乙酸均为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

Agilent Poroshell 120 Hilic色谱柱(100 mm×3.0 mm，2.7 μm);柱温30 ℃;流量0.5 mL·min－1;流动相为体积比60∶40的乙腈和乙酸盐缓冲溶液(pH 3.5)的混合溶液，等度洗脱;检测波长220 nm;进样量5μL。

1.3 试验方法

取1 g(精确至0.000 1 g)化妆品样品，置于10 mL具塞比色管中。加入5 mL 流动相，涡旋1 min，用流动相稀释至10 mL，超声提取20 min。取出，冷却至室温，必要时以10 000 r·min－1转速离心10 min。上清液过0.22μm 滤膜，滤液供HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

空白样品溶液和标准溶液的色谱图见图1。

图1 空白样品溶液和标准溶液的色谱图Fig.1 Chromatograms of the blank sample solution and standard solution

由图1可知:化妆品基质对肌肽的测定基本无干扰;肌肽保留效果良好，其保留时间约2.5 min。

2.2 色谱条件的选择

试验比较了分别以乙腈-0.1%(体积分数，下同)三氟乙酸溶液体系和乙腈-乙酸铵溶液体系作流动相时肌肽的分离效果。结果显示:以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液体系作流动相时，肌肽在色谱柱上的保留较弱(保留时间为1.3 min)，且色谱峰拖尾严重;以乙腈-乙酸铵溶液体系作流动相时，肌肽在色谱柱上有良好的保留，色谱峰峰形良好。进一步考察了水相中乙酸铵浓度分别为10，20 mmol·L－1，水相酸度分别为pH 3.5，4.0时对肌肽分离效果的影响。结果显示，水相中乙酸铵的浓度和水相酸度对肌肽分离效果影响不大。考虑到盐类物质对仪器的影响等因素，试验选择的流动相为体积比60∶40的乙腈和乙酸盐缓冲溶液(用乙酸调节10 mmol·L－1乙酸铵溶液酸度至pH 3.5)的混合溶液。

肌肽的最大吸收波长为218 nm，故试验选择220 nm 作为肌肽的检测波长。

2.3 提取剂的选择

肌肽极易溶于水，不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。考虑到肌肽的溶解特性和化妆品基质的性质，在进行样品前处理时，要求提取剂既能有效破乳又能充分提取肌肽。鉴于此，试验考察了分别采用流动相、体积比60∶40 甲醇-水体系以及体积比70∶30的乙腈-水体系作提取剂时对肌肽提取效果的影响。结果显示，以流动相提取样品时肌肽的回收率为86.7%～102%，以体积比60∶40的甲醇-水体系提取样品时肌肽的回收率为83.1%～88%，以体积比70∶30的乙腈-水体系提取时效果不佳，样品溶液呈浑浊态。因此，试验选择以流动相作提取剂。

2.4 标准曲线和检出限

按照仪器工作条件测定标准溶液系列，以肌肽的质量浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示，肌肽标准曲线的线性范围为5～200 mg·L－1，线性回 归方程 为y＝13.93x－22.27，相关系数为0.999 6。

分别以3，10倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N)，所得检出限为0.3 mg·L－1，测定下限为1.0 mg·L－1。

2.5 精密度和回收试验

对化妆水、乳液和膏霜空白基质进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验，每个浓度水平做6个平行样，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，所得结果见表1。

表1 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表1可知，肌肽的回收率为86.7%～102%，RSD 为1.3%～5.5%。

2.6 稳定性试验

将质量浓度为50 mg·L－1的肌肽标准溶液分别放置0，2，6，8，12，24 h 后按照仪器工作条件测定，计算肌肽保留时间和峰面积的RSD，结果分别为0.57%和3.6%，表明肌肽标准溶液在24 h 内稳定。

2.7 样品分析

按照试验方法分析7 款市售的含肌肽的化妆水、精华液、膏霜样品，除了1款样品未检出肌肽，其他6款样品中肌肽的检出量为12～958μg·g－1。

本工作采用亲水相互作用液相色谱法测定化妆品中肌肽的含量。该法操作简单、精密度高、回收率好，可为化妆品中肌肽的定性、定量监测提供参考。