脑脊液标志物在中枢神经系统淋巴瘤诊断和预测中的研究进展*

彭 余，冉隆荣，李 莲，赵明宇，罗 欣，陈 双，张 伟 综述，杨再林 审校

重庆大学附属肿瘤医院血液肿瘤中心，重庆 400030

中枢神经系统淋巴瘤(CNSL)主要为侵袭性肿瘤，包括原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSL)和继发性中枢神经系统淋巴瘤(SCNSL)两种临床亚型。PCNSL是一种高侵袭性的结外非霍奇金淋巴瘤，主要类型为原发性中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤；SCNSL主要为侵袭性淋巴瘤，累及中枢神经系统，常见的有弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤和淋巴母细胞淋巴瘤[1-2]。患者一旦发生淋巴瘤中枢神经系统浸润后预后差，病死率高。目前，脑组织活检虽是诊断CNSL的“金标准”，但存在发生手术并发症的风险，而且易出现误诊、漏诊现象；临床影像学检查诊断淋巴瘤中枢神经浸润存在假阳性、假阴性的结果，而且早期淋巴瘤中枢神经系统浸润的患者大多无明显临床表现。中枢神经淋巴瘤的早期识别与诊断仍是临床和实验室诊断的难点。脑脊液标本因具有获取方便、能动态监测疾病进展及变化的特点，已经成为诊断CNSL常用检测样本。研究证实，脑脊液的流式细胞免疫分型、细胞因子和基因检测等可用于CNSL的早期诊断及风险评估[3]。本文就脑脊液相关指标在诊断和预测CNSL中的研究进展作一综述。

1 流式细胞免疫分型

流式细胞免疫分型是运用不同的流式抗体组合，对脑脊液中淋巴瘤细胞表达的标志物进行分析，确定肿瘤细胞的类型及阶段，实现对疾病的诊断与监测。PCNSL起源于晚期生发中心的B淋巴细胞，肿瘤细胞主要表达B淋巴细胞标记，而SCNSL的肿瘤细胞标志物主要取决于浸润而来的肿瘤细胞类型。在正常脑脊液中，大部分细胞由CD3+的T淋巴细胞组成。正常的T细胞同时表达T细胞受体β链恒定区1(TRBC1)和T细胞受体β链恒定区2(TRBC2)；而肿瘤性T细胞只表达一个β链恒定区，即只表达TRBC1或TRBC2[4]。当CNSL来源于T细胞时，可以通过流式检测TRBC1及免疫表型来诊断淋巴瘤的中枢神经浸润。当CNSL来源于B细胞时，为单克隆B细胞，即CD19+的B淋巴细胞表现为轻链限制性(κ∶λ小于1∶3或大于3∶1)，并同时检测到B细胞其他的表型异常；而正常B细胞为多克隆，即无轻链限制性，无表型异常。为了更好鉴定脑脊液中的淋巴瘤细胞，推荐采用单管8色12种抗体组合的染色方案，使各类细胞可以清晰分群，通过直接标记CD45、CD8、CD20、CD4、CD56、CD5、CD19、SmIgκ、SmIgλ、TCRγδ、SmCD3、CD38等标志物对各类细胞进行分析[5]。相较于脑脊液细胞学检查，脑脊液流式细胞免疫分型对诊断和监测CNSL具有更高的敏感性[6-7]，但也存在一定的不足，如脑脊液标本中细胞数量少、寿命短，操作过程容易污染导致结果假阳性等[8]。

2 细胞因子检测

2.1白细胞介素(IL)-10 在淋巴瘤发生、发展过程中，IL-10主要参与B淋巴细胞的生长和分化。NGUYEN-THEM等[9]发现，脑脊液IL-10的水平可用于区分PCNSL与其他神经疾病，当脑脊液IL-10水平临界值为4 pg/mL时诊断PCNSL的灵敏度为88.6%，特异度为88.9%。SASAYAMA等[10]将24例通过核磁共振成像(MRI)检测怀疑为PCNSL的患者纳入前瞻性研究，分析发现有6例患者脑脊液IL-10水平较高，其中有5例诊断为PCNSL，而在脑脊液IL-10水平低于检测限的患者中没有PCNSL患者，提示脑脊液中IL-10的升高可能有助于诊断PCNSL。另有研究发现，较高的脑脊液IL-10水平与较短的无进展生存期相关[11]，而且脑脊液IL-10水平越高，Karnofsky性能评分越低[12]，表明脑脊液IL-10表达水平与PCNSL疾病预后密切相关。并且脑脊液IL-10表达水平变化早于MRI[12]，提示可通过检测脑脊液IL-10的水平变化更早地预测疾病发展趋势[11]。WANG等[13]综合分析了4项研究，发现当脑脊液IL-10水平临界值为6.88 pg/mL时，诊断CNSL的灵敏度和特异度分别为81%和97%。因此，脑脊液IL-10蛋白水平不仅可作为诊断CNSL的敏感的生物学标志物，也可用于疾病早期复发检测、预后评估和治疗方案的制订。

2.2IL-6及IL-10/IL-6比值 IL-6可募集T淋巴细胞并诱导细胞分化，参与免疫反应和炎症调节。UNGUREANU等[14]比较了28例PCNSL患者和15例中枢神经系统炎症性疾病(CNSID)患者脑脊液中IL-6和IL-10的水平，发现与健康对照组相比，CNSID组和PCNSL组脑脊液IL-6和IL-10水平均显著升高，PCNSL患者的脑脊液IL-10水平明显高于CNSID患者，而CNSID患者的脑脊液IL-6水平明显高于PCNSL，表明脑脊液IL-6和IL-10的联合检测可以更好区分CNSID和PCNSL两种疾病。多项研究表明，IL-10/IL-6比值对区分PCNSL和神经炎症性疾病有一定的诊断价值[15-16]，当IL-10/IL-6比值临界值为2.72时，其诊断PCNSL的灵敏度与特异度为74.2%和97.8%，而且IL-10与IL-10/IL-6比值联合诊断的灵敏度和特异度较单项诊断明显提高[17]。因此，对脑脊液IL-10和IL-6检测结果进行联合分析可提高CNSL诊断的特异度和灵敏度。

2.3趋化因子配体13(CXCL13) CXCL13可参与调节淋巴细胞发育，并趋化B细胞和辅助性T细胞归巢至生发中心[18]。MAEYAMA等[19]发现，CNSL患者脑脊液中CXCL13及CXCL13受体的表达明显高于其他中枢神经系统疾病，而且治疗后患者脑脊液CXCL13水平明显降低，复发患者脑脊液CXCL13水平明显升高，提示脑脊液CXCL13的表达水平与疾病预后呈负相关。此外，MASOURIS等[20]发现，CNSL患者脑脊液CXCL13的临界值为80 pg/mL时，其诊断的灵敏度和特异度为90.7%和90.1%。有研究报道，脑脊液中IL-10和CXCL13水平联合检测可提高诊断CNSL的特异度[21]。因此，脑脊液CXCL13不仅可作为诊断CNSL的生物标志物，也可作为CNSL的预后检测指标。

2.4可溶性IL-2受体 白细胞介素2受体(IL-2R)主要表达在活化的T细胞上，也会以可溶性IL-2R(sIL-2R)的形式释放到循环中，sIL-2R的半衰期较长[22]。研究表明脑脊液sIL-2R的水平变化对诊断淋巴瘤中枢浸润具有相对较高的灵敏度，是诊断淋巴瘤中枢浸润的有效生物学标志物[23]。SASAGAWA等[24]发现，CNSL患者脑脊液sIL-2R表达水平临界值为60.4 U/mL时，其灵敏度为94.7%，特异度为84.6%。同时，IKEGUCHI等[25]发现，CNSL患者脑脊液sIL-2R水平显著高于中枢神经系统炎症性脱髓鞘病患者，而且用脑脊液sIL-2R水平诊断CNSL时，其灵敏度与特异度分别为83.3%和90.0%。因此，脑脊液sIL-2R水平可作为CNSL诊断的生物学标志物。

2.5B细胞激活因子 B细胞激活因子(BAFF)是肿瘤坏死因子家族的配体，可参与调节B细胞的存活、成熟和分化，淋巴瘤细胞可以通过自分泌BAFF的方式逃避细胞凋亡[26]。MULAZZANI等[27]将116例疑似脑局灶病变患者纳入前瞻性研究，研究发现脑脊液BAFF蛋白水平可有效地诊断CNSL，且该指标的表达水平与疾病的预后密切相关。MIZUTANI等[28]发现，联合检测脑脊液BAFF和跨膜激活剂和CAML相互作用因子(TACI)的表达水平对诊断PCNSL具有高特异度和灵敏度。因此，脑脊液中的BAFF可以作为诊断CNSL和监测预后的生物学新指标。

2.6可溶性CD27(sCD27) CD27是淋巴细胞特异性TNF受体超家族成员，sCD27是游离的CD27蛋白单体，在T淋巴细胞和大多数B细胞恶性肿瘤细胞中都有不同程度的表达。KERSTEN等[29]通过前瞻性研究发现，脑脊液sCD27在诊断急性白血病和非霍奇金淋巴瘤中神经受累的灵敏度和特异度分别为100%、82%，但在感染性和炎症性中枢神经系统疾病的脑脊液中，sCD27表达水平也可能升高[30]，因此，脑脊液sCD27水平对诊断CNSL的特异性还需进一步研究探讨。

3 基因突变检测

CNSL患者中Toll样受体配体髓样分化因子88(MYD88)突变和B细胞抗原受体(BCR)亚基CD79b突变的发生率较高[31]。MYD88是一种Toll样受体配体，可激活IL-1和IL-18信号通路[32]，已有研究报道CNSL中MYD88基因发生高频率突变，其中以L265P位点基因突变最为常见[32-33]。CD79b突变常发生于编码BCR的基因上，最常见的是免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)Y196的错义突变。FERRERI等[34]对17例PCNSL患者进行了MYD88突变检测，共15例患者存在MYD88 L265P突变，阳性率为88%。以往研究分析发现MYD88突变在PCNSL中发生率为78.9%，而在SCNSL中为55.6%[2]。BRAGGIO等[35]通过阵列比较基因组杂交技术及全基因组测序技术分析了PNCSL患者中与免疫反应、增殖、凋亡和淋巴细胞分化相关的信号通路，发现90%以上的PNCSL患者中B细胞受体/Toll样受体/NF-κB通路发生改变。RADKE等[2]通过全基因测序比较了51例CNSL和75例淋巴瘤对照组患者的JAK-STAT、NF-κB、B细胞受体信号通路相关基因，发现在CNSL中MYD88 L265P突变占67%、CD79b突变占63%，周期素依赖性蛋白激酶抑制因子2A(CDKN2A)基因缺失占83%，MYD88 L265P突变和CDKN2A基因缺失可作为PCNSL发病早期的基因检测位点，而且PCNSL患者中端粒酶反转录酶(TERT)基因表达明显高于淋巴瘤对照组患者，该指标可提示PCNSL患者预后情况。

4 循环肿瘤DNA(ctDNA)

ctDNA是肿瘤细胞坏死或凋亡后释放至胞外的DNA，其半衰期短，可准确反映肿瘤当前情况，有助于对存在高危因素的淋巴瘤患者在疾病早期发现中枢神经系统浸润[36]。WATANABE等[37]通过对26例CNSL患者脑脊液ctDNA进行检测发现其中20例(76.9%)为MYD88突变。BOBILLO等[36]发现，相较于血浆ctDNA及FCM，脑脊液ctDNA可更好检测CNSL的发生，且对CNSL早期预测价值大于MRI或FCM。近期有多项研究通过检测脑脊液ctDNA变化来监测CNSL的预后情况[38-41]，提示脑脊液ctDNA可作为CNSL诊断及复发的早期检测指标及疾病预后监测指标。

5 微小RNA(miRNA)

miRNA是一种小的、非编码的、可调节的RNA分子，其主要是通过结合mRNA转录本的3′-非翻译区来调节其靶mRNA的表达[42-43]。BARANISKIN等[44]通过对PCNSL患者脑脊液中miRNA-21、miRNA-92a和miRNA-19b的联合检测，发现miRNA可以区分PCNSL患者与其他神经系统疾病，其灵敏度和特异度分别为95.7%和96.7%。同时研究发现联合检测脑脊液中miRNA-15b和miRNA-21的表达，可有效区分胶质瘤患者与PCNSL患者，诊断准确率达90%，特异度可达100%[45]。通过检测61例PCNSL患者和14例SCNSL患者脑脊液miRNA表达谱，发现SCNSL患者脑脊液miRNA-30c表达明显升高，这一指标可以有效区分SCNSL与PCNSL[46]，其灵敏度为90.9%，特异度为85.5%。由此可见，脑脊液miRNAs可作为诊断及鉴别CNSL的生物标志物。

6 其他蛋白标志物表达水平

研究发现，脑脊液中原蛋白(PGRN)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)和β2-微球蛋白(β2-MG)等表达升高，对诊断淋巴瘤中枢神经浸润也有一定的提示作用[3,47-48]。PGRN是一种分泌性糖基化蛋白，在肿瘤生长和生存中发挥着重要作用[48]。AT-Ⅲ蛋白参与血管内外的凝血过程，可调节肿瘤血管的生成，KUUSISTO等[49]发现，CNSL患者中脑脊液AT-Ⅲ表达明显升高，虽然不能独立作为诊断CNSL的标志物，但脑脊液AT-Ⅲ/清蛋白比值可作为诊断CNSL更为灵敏与特异的指标。β2-MG是细胞表面人类淋巴细胞抗原(HLA)的β链部分，主要由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生。MAEYAMA等[19]利用脑脊液CXCL13、IL-10、β2-MG和sIL-2R构建了多指标诊断模型，其诊断的灵敏度与特异度能达97%和97%。虽然AT-Ⅲ、β2-MG及PGRN这些脑脊液标志物对于CNSL的诊断并不特异，在其他神经系统炎症性疾病如脑膜炎中也可能升高，不能有效地区分CNSL与其他神经病变疾病，但这些检测指标联合其他生物学指标时，可提高诊断CNSL的灵敏度与特异度。

7 总结与展望

对淋巴瘤中枢神经系统浸润进行早期诊断、风险预测及早期干预目前仍是临床工作的难点。脑脊液流式细胞免疫分型、细胞因子检测、基因检测、ctDNA、miRNAs等多种新技术的发展也为诊断CNSL提供了新思路。随着流式细胞检测技术在临床中的应用，结合常规细胞学检查和病理学活检，诊断的灵敏度可提高2～3倍[5]。但由于脑脊液中细胞存活时间一般较短[7]，细胞数量少，流式细胞免疫分型及细胞基因检测对CNSL的诊断仍存在一定的局限性。脑脊液ctDNA和miRNA的检测可弥补流式细胞免疫分型与细胞基因检测的不足，具有一定的应用前景，但临床应用并不广泛。脑脊液细胞因子检测采用的标本为脑脊液离心后的上清液，对细胞数量无要求，而且可冷冻保存，在诊断及预测淋巴瘤中枢神经系统浸润中具有重要价值。脑脊液IL-10/IL-6比值可有效区分CNSID与CNSL，而且脑脊液CXCL13、sIL-2R、BAFF等生物学标志物均可有效诊断CNSL与其他神经系统性疾病。虽然脑脊液sCD27、AT-Ⅲ、β2-MG、PGRN等蛋白指标不能独立诊断CNSL，但联合检测多项脑脊液生物学指标检测可有效提高对CNSL诊断及预测的灵敏度与特异度。

综上所述，脑脊液样本获取方便，可动态监测疾病的进展，脑脊液流式细胞免疫分型联合细胞因子检测，可使标本得到更合理的利用。有条件时，多项指标的联合检测可提高诊断CNSL的灵敏度及特异度，为CNSL的早期诊断及预测提供更多参考。