木果柯功能性状的种内变异及其与遗传·环境和个体发育的关系

潘 霞,姚志良,杨 欣,田佳玉,林露湘，李巧明

(1.中国科学院西双版纳热带植物园热带森林生态学重点实验室,云南昆明 650223；2.中国科学院大学,北京100049;3.海南大学生态与环境学院,海南海口 570228；4.云南大学生态与环境学院暨云南省高原山地生态与退化环境修复重点实验室,云南昆明 650500;5.云南西双版纳森林生态系统国家野外科学观测研究站,云南勐腊 666303)

植物功能性状是与植物定植、生长、存活、繁殖有关的一系列植物属性[1-2]，这些属性可以单独或者联合指示植物对环境的适应与响应策略[3]，同时可以影响生态系统功能或过程[4]。功能性状在生态学研究中具有广泛的应用，如功能性状与植物生长、存活等的关系[5-7]，基于功能性状研究植物分布与环境的关系[8-10]，基于功能性状分布格局推导群落的构建机制[11-13]，功能多样性与生态系统功能的关系等[14-15]。基于功能性状的生态学研究通常采用物种多个个体功能性状的平均值来表征物种水平的功能性状。然而，性状平均值只是对某一区域内若干个体变异的统计描述，其有效性与个体变异幅度密切相关[16]。在很多情况下，功能性状在种内的变异不可忽视，如功能性状种内变异对植物的分配性状和器官水平性状的作用不同[17]；功能性状种内变异影响着生物与生物之间及生物与其环境之间的相互作用[18-19]，影响着种群的数量和动态[20-21]，在物种共存[22]和群落构建中有重要作用[23-24]。大多数研究仅仅关注物种水平的功能性状，较少考虑功能性状的种内变异。然而，已有越来越多的研究发现功能性状种内变异在生态学研究中的重要性[25-27]。

功能性状的种内变异是同种生物的不同个体表型差异的一种具体体现[28]，通常是由于个体之间的遗传变异和物种本身的表型可塑性产生。遗传变异是个体基因型之间的表型变异，由遗传漂变、自然选择、基因突变、迁移产生，在群体水平上又称遗传多样性，随着基因型数量在种群内增加，种群内个体间的差异也会更明显[29]。基因型之间竞争能力的差异可能导致局域尺度上的非传递性竞争，允许竞争对手在更大尺度上实现共存[19-30]。在一些模式植物中，某些功能性状的变异很大程度上受遗传变异的控制[31-32]。表型可塑性是单个基因型在不同环境条件下所表达的表型变异[33]，体现了一个物种对环境变化的适应与响应[34]，是植物应对环境变化的重要机制之一。研究表明，植物分布范围越广，所处的环境变化越大，个体往往在其性状上表现出广泛的变异性，这通常被解释为环境条件或局域适应变化，功能性状种内变异越大，说明环境因子对功能性状的塑造越明显[34-35]。个体发育被认为是同种生物不同个体间种内变异的主要来源[36]，是由个体发育调节的性状表达变化引起的，这些性状表达可能与环境相互作用，也可能独立于环境而发生[37]。在干旱条件下，叶片氮含量和叶片光合性状随年龄而发生显著变化，但不随水分处理而变化[38]；幼年时期，植物的叶面积、比叶面积和叶干物质含量变化更大，即与植物快速生长相关的性状变化更大，而成年后植物功能性状变异比幼年时期小，功能性状策略更趋近于保守[39]。全球植物群落中植物功能性状变异约25%由种内变异产生[26]。

对功能性状种内变异来源的认知是群落和生态系统研究中准确应用功能性状的前提[40-41]。总体来说，种内变异的来源可以大致归为3类：环境异质性[35，42-44]、遗传变异[45-46]和个体发育阶段差异[47-49]。笔者依托在哀牢山北段按公里网格布设的20个亚热带常绿阔叶林1 hm2动态样地，选取样地内所有的木果柯DBH≥10 cm的个体，总计820株作为研究对象，测量其个体水平的6个功能性状(叶面积、比叶面积、叶片厚度、叶干物质含量、叶绿素含量和枝条木质密度)，解析在区域尺度上个体发育阶段差异、环境异质性和遗传变异对木果柯各功能性状种内变异的相对作用，旨在为深化理解功能性状种内变异的来源提供证据支持。

1 材料与方法

1.1 研究区概况该研究在哀牢山亚热带常绿阔叶林公里网格生物多样性观测平台中采样，该观测平台位于云南省中部，连接云贵高原、横断山地和青藏高原，是滇中高原与滇西纵谷区的分界线[50]。哀牢山北段徐家坝地区位于101°02′E，24°32′N，海拔2 460 m，西坡山麓的川河坝区在哀牢山与无量山包围的山谷中，属于亚热带季风气候，气候随海拔呈现出中亚热带、北亚热带和暖温带气候等不同的气候类型，年平均气温为11 ℃，最热月平均气温为16.4 ℃，极端低温为-8.3 ℃[50-51]。哀牢山北段有丰富的植物资源，其中物种分布有裸子植物6科11属13种，被子植物139科424属792种，包括松科(Pinaceae)、柏科(Cupyressaceae)、杉科(Taxodiaceae)、壳斗科(Fagaceae)和樟科(Lauraceae)等[51-52]。该研究样地设置根据美国史密森热带研究所热带森林科学中心(Center for Tropical ForestScience,CTFS)的样地建设标准[53]。徐家坝地区已经建成20个1 hm2的样地，每个样地之间最近距离为430 m，最远距离为6 647 m。

1.2 研究材料木果柯(Lithocarpusxylocarpus)，属于山毛榉目壳斗科柯属植物，乔木，植株高达30 m，胸径90 cm，灰褐色树皮，叶片椭圆形或者倒披针形，革质，嫩叶背面有卷柔毛，叶片干后正面光泽油润，叶柄长约1 cm。常雌雄同序，花序轴被绒毛；雌花每3朵1簇，花柱长达2 mm；壳斗近圆球形，全包坚果；坚果为近圆球形或宽椭圆形，花期5—6月，果次年9—10月成熟[54]。

1.3 研究方法

1.3.1功能性状的测定及种内变异的度量。该研究共选取6个功能性状：叶面积(leaf area,LA)、比叶面积(specific leaf area,SLA)、叶绿素含量(chlorophyll content,CC)、叶片厚度(leaf thickness,LT)、叶片干物质含量(leaf dry matter content,LDMC)、枝条木质密度(branch-wood density,B-WD)，用枝条木质密度代替木质密度[55]。功能性状的生态策略见表1[56-60]。于2021年3—4月(旱季)对样地内所有DBH ≥ 10 cm的木果柯个体的叶片和小枝进行采样并进行功能性状测量，方法均参考功能性状采集及测量手册的方法[3-60]。

表1 木果柯6种功能性状所代表的生态策略

具体测量方法：每个个体在外围向阳面选取3片健康完好叶片，所采叶片都带完整叶柄，在叶片采集的同时用SPAD-502叶绿素仪测定叶绿素含量并记录。测量后将叶片装入自封袋，自封袋中提前喷水放入纸巾保湿，带回实验室。当天用1/1 000精度的电子天平测量叶片鲜重，用游标卡尺测量叶片厚度并记录。随后将叶片放置于扫描仪上扫描，扫描后的叶片图像存入电脑，以便于进一步用imageJ图像软件计算叶片面积。将扫描完的叶片装入信封，用烘箱在70 ℃下烘72 h至恒重，然后用1/1 000精度的电子天平称量其干重并记录。枝条密度是采集其向阳面第1分支的枝干10～15 cm，并用湿纸巾包裹好放入自封袋中，当天回到实验室用水替代法测定其体积。将测量好的枝条放在70 ℃烘箱中烘干72 h后称重并记录。

将测量的功能性状数据进行标准化处理，利用R软件中dist()函数计算木果柯个体两两之间的欧式距离，处理获得两两个体间的功能性状距离矩阵。

1.3.2个体发育阶段差异的度量。为探究木果柯功能性状种内变异否受到个体发育阶段差异的影响，依据木果柯实际测量的胸径，计算个体间胸径差的绝对值[式(1)]，然后做两两间的距离矩阵,表征个体发育阶段的差异。

ΔDBHij=|DBHi-DBHj|

(1)

式中,i，j代表2个不同的个体。

1.3.3遗传变异的度量。利用3 × CTAB法，提取所有木果柯的DNA。采用微卫星标记技术(simple sequence repeat,SSR)对木果柯进行遗传多样性检测和分析[61]，在文献中筛选出12对微卫星简单重复序列引物，引物信息见表2[62-65]，对所有木果柯个体进行扩增，获得基因分型数据。由SSR检测结果，利用SequentiX GelQuest软件读取峰值，整理出基因型数据，用GenA1Ex6.2软件和MSA4.05软件进行微卫星位点的遗传多样性分析，并构建木果柯两两个体之间的遗传距离矩阵。

表2 用于微卫星扩增的引物序列

1.3.4环境因子的测定及环境距离的度量。环境因子是在样地内10 m桩位置上，利用全站仪打点得到相对高差，再根据实时差分定位(Real-time kinematic,RTK)实测的四角坐标的海拔进行校正，得到10 m桩中每个点的海拔，基于10 m桩海拔数据计算每个10 m×10 m小样方的海拔、坡度、坡向和凹凸度。以每个小样方4个顶点处的海拔均值作为该样方的海拔；以目标样方任意3个角构成的平面与水平面夹角的平均值作为该样方的坡度；以目标样方的海拔减去其周围8个样方的平均海拔作为该样方的凹凸度，位于样地边缘或四角的样方，其凹凸度值则由该样方的海拔减去与其邻接的若干个样方的平均海拔获得[66-67]。坡向采用式(2)进行计算：

(2)

式中,fx和fy分别为该样方从东到西和从北到南的海拔差值。坡向范围为[0,2π]的环形变量，因此需要对其进行正弦和余弦转化，变成线性变量纳入后续分析中。笔者利用每个木果柯在样地中的坐标数据，计算每个木果柯个体在10 m×10 m样方中的环境因子数据，采用R软件的dist()函数计算木果柯个体两两之间环境因子的欧式距离，获得环境距离矩阵。

1.3.5基于距离矩阵的多元回归。该研究采用基于距离矩阵的多元回归(multiple regression on distance matrices，MRM)[22]评估环境距离矩阵、遗传距离矩阵和个体发育距离矩阵对木果柯各功能性状两两个体之间的距离矩阵相对效应。MRM是基于mantel检验的一种统计方法，通过几个距离矩阵来解释某一距离矩阵的变化[68]。由于距离矩阵的值均由两两样本之间的距离计算得到，观测值之间不独立，自由度降低，不能用简单的多元回归来评估各解释变量的相对重要性[69]。MRM由R软件中ecodist包来实现[70]。该研究以木果柯各功能性状的两两个体间的距离矩阵作为因变量，遗传距离矩阵、个体发育距离矩阵和环境距离矩阵作为自变量，用森林图展示自变量的MRM标准化回归系数，通过比较回归系数反映自变量对因变量作用的相对大小。

2 结果与分析

2.1 木果柯功能性状的种内变异对样地内820株木果柯的功能性状进行测量，功能性状种内变异的范围如图1所示。从木果柯6类功能性状种内变异结果可知，各功能性状都存在不同程度的种内变异，叶面积的变化范围为10.6～92.9 cm2，比叶面积的变化范围为40.0～132.2 cm2/g，叶绿素含量的变化范围为36.8～64.7 μg/cm2，叶片厚度的变化范围为0.12～0.36 mm，叶干物质含量的变化范围为0.39～1.14 mg/g，枝条木质密度的变化范围为0.39～0.93 g/cm3(表3)。

图1 木果柯所有个体(DBH ≥ 10 cm)6个功能性状的频率分布Fig.1 The frequency distribution of six functional traits of all individuals (DBH≥10 cm) in Lithocarpus xylocarpus

表3 木果柯6个功能性状的种内变异程度

2.2 个体发育、环境因子和遗传变异与功能性状种内变异的关系利用MRM方法对木果柯个体每个功能性状进行分析，结果如图2所示，个体发育对叶面积呈显著正效应，遗传变异和环境对叶面积无显著效应；个体发育和遗传变异对叶片厚度呈显著负效应，环境因子对叶片厚度呈显著正效应；个体发育、环境和遗传变异对叶绿素含量均呈显著正效应；个体发育、遗传变异和环境对比叶面积均呈显著正效应；个体发育和遗传变异对叶干物质含量呈显著负效应，环境对叶干物质含量呈显著正效应；个体发育和环境对枝条木质密度呈显著负效应，遗传变异对木质密度无显著效应。

注：***.P<0.001。图2 木果柯个体之间的遗传变异、环境距离和个体发育阶段差异对功能性状变异的影响效应Fig.2 The effects of genetic variation,environmental distance and difference of ontogenetic stage on the variation of the functional traits among individuals of Lithocarpus xylocarpus

光照和林下覆盖度是影响种内变异的主要环境因子[71]，笔者根据Dawkins等[72]提出的树冠曝光指数(crown exposure index,CEI)或光照指数(crown illumination index,CII)通过对树冠在林冠中的暴露程度对个体树冠所处的光环境进行半定量评价，结合笔者对木果柯个体采样时记录的采样高度(用高枝剪采样，选取向阳面能采到的最大高度)的分析，发现采样高度与树冠曝光指数呈显著正相关(图3)；将木果柯各功能性状与采样高度进行分析，发现叶绿素含量、叶片厚度与采样高度呈显著正相关，比叶面积与采样高度呈显著负相关(图4)。

注：不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant difference between treatment (P<0.05).图3 树冠曝光指数与采样高度的关系Fig.3 Relationship between crown exposure index and sampling height

图4 木果柯所有个体的6个功能性状与采样高度之间的关系Fig.4 The relationship between six functional traits and sampling height in all individuals of Lithocarpus xylocarpus

3 讨论

尽管有越来越多的证据表明种内变异对植物性状变异的重要性，然而，在亚热带常绿阔叶林中植物功能性状种内变异的程度与植物功能性状种内变异的来源鲜见报道。该研究表明，环境因子、个体发育阶段的差异以及遗传变异在木果柯不同性状的相对贡献存在差异，这与Karbstein等[73]对白车轴草进行功能性状种内变异的遗传多样性和生境异质性研究结果类似，遗传多样性和生境异质性显著影响了功能性状种内变异。遗传变异对大部分木果柯功能性状种内变异都有显著影响，这与前人对性状变异或植物适合度与物种遗传多样性的研究结果一致[74-75]。研究表明，优势种或者基础物种的种内遗传变异可能会影响大量的从属物种，优势种的基因型多样性产生了空间异质性，在大的空间尺度上有利于不同微环境中不同植物物种的共存[45]。在欧洲山杨的研究中发现，树皮附生植物的群落组成受到了杨树基因型变异的显著影响[76]。木果柯作为群落中的上层优势种，其生态位宽度大，群落结构稳定，给林下植物提供了持续适宜的生长环境，为蕨类植物和苔藓植物提供了良好的生态空间[77]。Liu等[78]研究发现，木果柯个体密度在样地中的占比不大，但是地上生物量以及枯死木却达到了50%以上，给林下微生物和土壤提供了大量养分。

该研究中环境因子主要是坡度、坡向、凹凸度和海拔，环境因子对木果柯各功能性状除了叶面积以外，均有显著影响，说明木果柯为适应环境条件变化，性状也随之改变。一般来说，低海拔地区叶片大而薄，高海拔地区的植物叶片小而厚，叶片性状随海拔梯度变化的高度变异是植物对环境中的辐射量、二氧化碳浓度、温度等环境限制的响应[79-80]。Umaa等[81]研究发现，叶片韧性与海拔变化呈正相关，比叶面积与海拔变化呈负相关，研究中6个物种有5个物种的木质密度与海拔变化的相关性不显著。同一生境内，不同的坡度和坡面暴露对土壤湿度有影响，从而使植物生物量和叶面积增加或减少[73]。

除了受适应性和可塑性的影响外，性状表达也因个体发育阶段不同而发生变化，个体发育的影响可能根据所测量的性状不同而有所不同。Liu等[82]利用亚热带森林中59种乔木间隔5年的生长和性状观测数据研究表明，个体水平上的功能性状与个体生长速率密切相关。在热带地区，个体发育对木材密度的影响较大，而对叶干物质含量的影响较小[83]。李晶晶[84]采集了局域尺度样地内所有椆琼楠样本，探讨了该物种功能性状种内变异的来源，结果显示影响椆琼楠功能性状种内变异的主要因子是个体发育。该研究中，个体发育对不同功能性状有不同的效应，对叶面积、比叶面积、叶绿素含量有显著正效应，对叶干物质含量、叶片厚度、枝条木质密度有显著负效应，说明在木果柯个体发育不同阶段，各功能性状有不同的生存策略，这是木果柯功能性状在个体发育阶段为应对外界变化或者为了更好地生存与繁殖的一种权衡，更加表明在不同功能性状中，个体发育对性状的塑造也是至关重要的。

4 结论

该研究分析了木果柯各功能性状种内的变异程度，并探讨了环境异质性、个体发育和遗传变异对木果柯功能性状种内变异的影响，主要结论如下：①木果柯各功能性状均存在不同程度的种内变异，其中叶面积变异最大，其次是比叶面积和叶片厚度，木质密度、叶干物质含量和叶绿素含量变异较小；②遗传、环境和个体发育三者均是功能性状种内变异的来源，其对不同功能性状种内变异的塑造具有不同的重要性，其中个体发育阶段差异对叶面积的正效应最强，其次是遗传变异，环境距离的正效应最弱；遗传变异对叶绿素含量种内变异的正效应在所有性状中最强，而环境距离对比叶面积的正效应在所有性状中最强。

该研究进一步证实了种内变异在功能性状研究中的重要性，通过探索哀牢山亚热带常绿阔叶林中的建群种木果柯功能性状种内变异程度以及功能性状种内变异来源，阐明了环境异质性、个体发育和遗传变异在木果柯功能性状种内变异研究中的重要性，为木果柯功能性状种内变异研究提供了重要依据。