阿仑膦酸钠对去卵巢小鼠骨质量及脏器病理学的影响

王龙飞，高玉海，杨世超，黄睿馨，李 幸，杨玉田，轩莹莹，唐汉琴，陈克明，3

（1.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院基础医学实验室，甘肃 兰州 730050；3.甘肃省干细胞与基因药物重点实验室，甘肃 兰州 730050）

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一种女性特有的全身性骨代谢性疾病，主要发生于绝经后5～10 年间，女性绝经后卵巢功能衰退，雌激素水平降低导致骨量丢失，引起骨质疏松［1］。PMOP 患者会出现骨代谢异常，骨形成和骨吸收平衡破坏，导致骨密度及骨组织含量降低，从而诱发腰背酸痛、全身乏力和骨折等一系列PMOP 症 状［2，3］。据 统 计，约10%～20%绝 经 后 女性患有不同程度骨质疏松，而绝经后骨质疏松症相关脆性骨折发生率和发病率很高，丧失劳动力者非常普遍，严重影响患者生活质量［4，5］，随着全球人口的老龄化，PMOP 的发病率急剧增加，由于PMOP的高发病率和破坏性并发症，它已成为一个全球公共卫生问题［6］。阿仑膦酸钠是治疗绝经后骨质疏松症的一线骨吸收抑制剂，能使成骨细胞分泌骨保护素并且抑制破骨细胞的聚集作用，抑制破骨细胞形成来提高骨量［7］。本研究以去卵巢小鼠为PMOP 模型，观察骨质疏松小鼠骨强度，骨代谢和脏器病理学的变化，进一步探讨阿仑膦酸钠抗PMOP 的作用潜在价值。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

阿仑膦酸钠（Sigma-Aldrich，产品批号：PHR1599）；骨钙素（OCN）定量检测试剂盒（泉州睿信生物科技有限公司，产品批号：20220704-20334B）；抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP-5b）定量检测试剂盒（泉州睿信生物科技有限公司，产品批号：20220704-20441B）；I 型前胶原N 端前肽（PINP）定量检测试剂盒（泉州睿信生物科技有限公司，产品批号：20220704-20072B）；I 型胶原交联C 端肽（CTX-I）定量检测试剂盒（泉州睿信生物科技有限公司，产品批号：20210518-35628B）；microCT（平生医疗科技昆山有限公司，中国）；BX51+DP71 型显微镜（奥林巴斯公司，日本）；万能力学试验机（Instron5565，美国）。

1.2 实验动物与分组处理

8 周龄SPF 级C57BL/6 小鼠30 只，体重（18±2）g，购自空军军医大学实验动物中心，合格证号：SCXK（陕）2019-001。饲养于联勤保障部队第九四〇医院SPF 级动物实验中心，许可证编号：SYXK（军）2017-0047。小鼠造模前按随机数字表法分为3 组，每组10 只，分别为假手术组（Sham）、去卵巢组（OVX）及去卵巢+阿仑膦酸钠组（ALN）。除Sham组切除卵巢体积相同脂肪外，其余各组均由背部行双侧卵巢摘除术。术后连续肌注3 d 青霉素。ALN组每周阿仑磷酸钠400 μg/kg 皮下注射2 次，Sham组和OVX 组每周等体积的生理盐水皮下注射2 次。为防止切卵巢后小鼠体重上升过快，每天给小鼠定量喂食，所有小鼠的喂食量按照假手术组每天进食量给予，术后1 周开始给药。实验期间注意皮毛的色泽、观察小鼠生理反应与生活习性的变化，每一周称一次体重。给药第12 周处死小鼠取材，取材前禁食不禁水24 h。

1.3 脏器病理学指标分析

小鼠取材时，摘取主要脏器包括心、肝、脾、肺、肾和子宫，剥离周围多余组织，称量脏器的体质量并计算脏器系数（脏器系数=脏器体质量/小鼠体质量）。固定于10%甲醛固定液中，进行石蜡包埋、切片和HE 染色（苏木精-伊红染色法），显微镜下观察各脏器有无病理学改变。

1.4 骨组织病理学指标分析

小鼠取材时，将刚剥离的股骨放在多聚甲醛固定24～48 h，固定后放入EDTA 脱钙液，每7 d 换一次脱钙液，直到用针穿透骨组织的时候没有阻力为止。进行石蜡包埋、切片和HE 染色（苏木精-伊红染色法），显微镜下观察骨组织有无病理学改变。

1.5 microCT 分析

小鼠取材时，每组随机挑出6 根左侧股骨固定在4%多聚甲醛中。固定好的样本存放于4℃冰箱内。实验时，用镊子取出样本并用纱布擦走多余的液体后，用干净的纸巾将样品包裹放入Micro CT 试验机中。扫描后得到大量层切图片，再经重建软件进行3D 重建，截取最大剖面图与横截面图。选择骨骺线下1 mm～1.5 mm 处为感兴趣区进行分析，得到分析区域松质骨的骨形态参数。选择骨骺线下2.5 mm～3 mm 处为感兴趣区进行分析，得出该区域皮质骨的骨形态参数。得到横截面图、最大剖面图以及骨形态参数包括骨小梁骨密度（Tb.BMD）、骨小梁数（Tb.N）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨体积分数（Tb.BV/TV）、皮质骨密度（Ct.BMD）和皮质骨厚度（Ct.Th）。

1.6 L4 椎体生物力学检测

从冰箱取出纱布包裹的椎骨，常温下自然解冻后用于骨生物力学检测。腰椎压缩实验：从小鼠椎骨中剥离第4 腰椎椎体（L4），去除周围多余的肌肉组织，用砂纸磨平L4 锥体的上表面与下表面，直到上表面与下表面平行且能竖直立于桌面为止，加载速度设为1 mm/min，开始实验后力试验机垂直平稳的施压于椎骨，直至椎骨被压碎后实验停止，记录其弹性模量和最大载荷。

1.7 血清生化指标检测

小鼠取血采用腹主动脉抽血，每只小鼠取血量0.6 mL 左右，取血结束后室温下静置30 min，设置3 000 r/min，时间15 min，取离心后的上层血清后放入-80℃超低温冰箱保存；自然解冻后，用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测450 nm 处的吸光度OD 值，按说明书绘制标准曲线并计算出骨钙素（osteocalcin，OCN）、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate resistant acid phosphatase-5b，TRACP-5b）、I 型前胶原N 端前肽（procollagen type I aminoterminal peptide，PINP）和Ⅰ型胶原C 端肽（C-terminal type I collagen telopeptide，CTX-I）的 含 量，结 果 表 示 为ng/mL。

1.8 统计学处理

应用SPSS 23.0 软件进行统计学分析。满足正态分布的计量资料用均值±标准差（±s）表示，不同组间差异用单因素方差分析，符合正态分布且方差齐性用LSD，不符合方差齐性用塔姆黑尼T2，进行两两比较，若数据不服从正态分布，则采用秩和检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALN 对小鼠脏器系数的影响

如表1 所示，小鼠的心、肝、脾、肺、肾的器官指数组别间均无统计学差异（P＞0.05）。Sham 组子宫系数为（0.005 4±0.000 7），OVX 组和ALN 组小鼠的子宫系数分别为（0.002 6±0.000 9）和（0.002 5±0.000 7），由以上数据可以看出Sham 组子宫系数显著的高于OVX 组和ALN 组（P＜0.01），这是由于小鼠切除卵巢后由于雌激素缺乏导致子宫发生萎缩使子宫系数降低。

表1 各组小鼠的主要器官的器官系数比较（n=10，±s）Tab 1 Comparison of organ coefficients of major organs in each group（n=10，±s）

表1 各组小鼠的主要器官的器官系数比较（n=10，±s）Tab 1 Comparison of organ coefficients of major organs in each group（n=10，±s）

注：与Sham 相比,##P＜0.01。

指标F P Sham 组OVX 组ALN 组0.198 0.170 0.945 0.254 0.215 0.000心肝脾肺双肾子宫0.005 7±0.001 0 0.037 5±0.003 3 0.003 2±0.000 4 0.007 1±0.000 7 0.012 1±0.000 6 0.005 4±0.000 7 0.005 4±0.000 6 0.038 9±0.001 6 0.003 1±0.000 5 0.007 1±0.000 7 0.011 0±0.000 9 0.002 6±0.000 9##0.005 0±0.000 5 0.035 6±0.003 8 0.003 2±0.000 4 0.006 5±0.000 4 0.011 4±0.001 5 0.002 5±0.000 7##1.783 1.939 0.056 1.525 1.667 31.565

2.2 脏器的病理学观察结果

从小鼠的脏器心、肝、脾、肺、肾，肉眼观察并无形态和色泽的明显改变，但是子宫有明显的萎缩。显微镜下观察小鼠主要脏器的HE 切片，未发现各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾病理学异常改变（图1）。OVX 组和ALN 组子宫内膜组织腺体稀少并且萎缩变薄，表面为一层小而圆的单层上皮细胞；Sham 组子宫内膜较厚，腺体较多，表面为一层高而密的假柱状上皮。

图1 小鼠主要脏器组织病理学检查结果（HE， 40×）Fig 1 Histopathological examination results of major organs in mice（HE，40×）

2.3 骨组织的病理学观察结果

通过对小鼠股骨进行脱钙切片和HE 染色后进行观察（图2），发现OVX 组的骨髓腔脂肪细胞填充较多，骨小梁比较稀疏和细小。Sham 组和ALN 组的骨髓腔脂肪细胞填充较少，骨小梁比较致密和紧凑。

图2 小鼠骨组织病理学检查结果（HE， 10×）Fig 2 Bone histopathological examination results of mice（HE，10×）

2.4 micro CT 扫描及分析

股骨正中剖面图（图3）显示，OVX 组与Sham组相比，松质骨比较疏松，骨小梁数量减少，骨小梁间间距扩大，骨小梁与骨小梁间的连续性与延展性较差。其中ALN 组与Sham 组相比，股骨松质骨的骨微结构质量基本一致。从骨小梁横切图（图4）显示，OVX 组骨小梁比较稀疏，Sham 组和ALN 组明显更加紧密。从骨小梁3D 图（图5）看出OVX 组骨小梁数目明显较少，Sham 组和ALN 组骨小梁数目明显较多。从皮质骨3D 图（图6）和皮质骨横切（图7）未 发 现OVX 组 与Sham 组 和ALN 组 的 明 显差异。

图3 小鼠股骨Micro CT 成像分析最大剖面图Fig 3 Maximum profile of Micro CT imaging analysis of mouse femur

图4 小鼠股骨Micro CT 成像分析骨小梁横切Fig 4 Micro CT imaging of trabecular bone transection in mouse femur

图5 小鼠股骨Micro CT 成像分析骨小梁3DFig 5 Micro CT imaging of trabecular bone and in 3D of mouse femur

图6 小鼠股骨Micro CT 成像分析皮质骨3DFig 6 Micro CT imaging of mouse femur and 3D of cortical bone

图7 小鼠股骨Micro CT 成像分析皮质骨横切Fig 7 Micro CT imaging of mouse femur cortical bone transection

由表2 可见，通过比较松质骨和皮质骨的骨形态参数，发现ALN 组的小鼠与OVX 组小鼠比较，数值在Tb.BMD、Tb.N、Tb.Th 和Tb.BV/TV 均有显著性增加、Tb.Sp 数值显著性减少（P＜0.01），证明ALN 提高骨质量，是通过增加骨密度和改善骨组织的结构。ALN 组与OVX 组的Ct.BMD 和Ct.Th 比较无统计学差异（P＞0.05）。

表2 小鼠股骨Micro CT 松质骨和皮质骨各指标的比较（±s，n=10）Tab 2 Comparison of indexes of cancellous bone and cortical bone in mouse femur with micro CT（±s，n=10）

表2 小鼠股骨Micro CT 松质骨和皮质骨各指标的比较（±s，n=10）Tab 2 Comparison of indexes of cancellous bone and cortical bone in mouse femur with micro CT（±s，n=10）

注：与OVX 相比,**P＜0.01；与Sham 相比,##P＜0.01。

指标Tb.BMD(g/cm3)Tb.N(mm-1)Tb.Sp(mm)Tb.Th(mm)Tb.BV/TV（%）Ct.BMD(g/cm3)Ct.Th(mm)Sham 组1.205±0.006 2.826±0.129 0.256±0.011 0.088±0.006 0.156±0.011 1.807±0.023 0.281±0.010 OVX 组1.182±0.003##2.586±0.154##0.304±0.023##0.079±0.004##0.105±0.013##1.790±0.021 0.275±0.011 ALN 组1.229±0.014**3.369±0.401**0.229±0.003**0.095±0.005**0.224±0.037**##1.785±0.014 0.275±0.006 F P 0.000 0.000 0.000 0.001 0.000 0.074 0.346 42.522 16.659 23.660 11.417 24.345 2.928 1.111

2.5 L4 椎体生物力学检测结果

如表3 所示，小鼠椎骨第四锥体（L4）的压缩实验结果显示，ALN 组的弹性模量和最大载荷数分别为（50.29±13.43）和（29.83±4.92），OVX 组的弹性模量和最大载荷数分别为（14.77±3.12）和（11.57±3.18），ALN 组的弹性模量和最大载荷数值都显著高于OVX 组（P＜0.01），结果表明，ALN 可以提高实验小鼠的L4 椎体生物力学性能。

表3 小鼠L4 锥体压缩实验结果比较（n=10，±s）Tab 3 Comparison of L4 cone compression test results inmice（n=10，±s）

表3 小鼠L4 锥体压缩实验结果比较（n=10，±s）Tab 3 Comparison of L4 cone compression test results inmice（n=10，±s）

注：与OVX 相比，**P＜0.01。

最大载荷/N 29.37±4.64 11.57±3.18 29.83±4.92**17.663 0.002组别Sham 组OVX 组ALN 组FP弹性模量/mPa 49.44±22.01 14.77±3.12 50.29±13.43**6.314 0.019

2.6 ALN 对小鼠血清骨代谢生化指标的影响

如表4 所示，OVX 组的血清的骨形成指标OCN 和PINP 的平均含量为7.81 ng/mL 和29.91 ng/mL，ALN 组的血清OCN 和PINP 的平均含量为10.72 ng/mL 和56.65 ng/mL 显 著 的 高 于OVX 组（P＜0.01）。 OVX 组 的 血 清 的 骨 吸 收 指 标TRACP-5b 和CTX-I 的平均含量为7.47 ng/mL 和12.94 ng/mL，ALN 组的血清TRACP-5b 和CTX-I的平均含量为4.84 ng/mL 和8.86 ng/mL 显著的低于OVX 组（P＜0.01）。OVX 组血清中骨形成指标OCN 和PINP 与Sham 组相比都呈下降趋势，骨吸收指标TRACP-5b 和CTX-I 都呈上升趋势，但是ALN 组的骨形成和骨吸收指标与Sham 组的趋势基本相似。数据结果表明ALN 组是促进骨形成和抑制骨吸收来预防切卵巢引起的小鼠的骨量丢失。以上结果表明，ALN 既能促进小鼠骨形成又可以抑制骨吸收。

表4 小鼠给药3 个月后各组OCN、TRACP-5b、PINP、CTX-I的比较（ng/mL，n=10，±s）Tab4 drugs in mice after 3 months each OCN，TRACP-5 b，PINP，the comparison of CTX-I（ng/mL，n=10，±s）

表4 小鼠给药3 个月后各组OCN、TRACP-5b、PINP、CTX-I的比较（ng/mL，n=10，±s）Tab4 drugs in mice after 3 months each OCN，TRACP-5 b，PINP，the comparison of CTX-I（ng/mL，n=10，±s）

注：与OVX 相比，**P＜0.01；与Sham 相比，##P＜0.01。

组别Sham 组OVX 组ALN 组FP CTX-I 7.04±1.27 12.94±0.85##8.86±1.46**46.532 0.000 OCN 13.10±2.04 7.81±1.12##10.72±0.81**23.747 0.000 TRACP-5b 4.57±0.76 7.47±1.11##4.84±0.76**24.455 0.000 PINP 53.94±8.23 29.91±3.65##56.65±9.79**26.113 0.000

3 讨论

绝经性骨质疏松是与妇女年龄紧密有关的骨科疾病，妇女到达一定年纪时体内的雌激素就会下降导致骨组织结构变化，使骨脆性增加和骨量减少导致骨折的发生［8］。绝经性骨质疏松有两种，第一种为绝经后早期骨质疏松；第二种是绝经后晚期骨质疏松［9］。阿仑膦酸钠是治疗绝经性骨质疏松有效的药物，主要通过抑制破骨细胞的活性并促进凋亡，还能诱导成骨细胞分泌抑制因子来阻断破骨细胞启动的破骨过程，抑制骨吸收［10］。通过实验证明阿仑膦酸钠可以有效的改善OVX 小鼠骨组织结构、增加骨量、抑制破骨细胞的吸收和促进成骨细胞的活性。

在正常人体内的骨微环境中，骨代谢的动态平衡对于维持骨量稳定至关重要［11］。骨重建是严密调控的过程，通过连贯的骨吸收和骨形成活动，确保微损伤的修复和新骨替换旧骨，保证骨骼的完整性［12］。骨质疏松症发生的最根本原因是由环境、遗传、内分泌和年龄因素等导致的骨代谢失衡，即骨形成作用弱于骨吸收作用，新的骨基质的产生速度小于旧骨基质的吸收。通过血清生化指标证明阿仑膦酸钠可以使小鼠的骨吸收与OVX 小鼠相比明显的降低，骨形成与OVX 小鼠相比明显的升高，实验结果说明阿仑膦酸钠可以有效的降低骨吸收，增加骨形成来调节骨代谢。

实验结束后，计算了各组小鼠主要脏器包括心、肝、脾、肺、肾与子宫的脏器系数，并利用SPASS软件对其数据进行分析，ALN 组和OVX 组子宫系数明显降低，OVX 组和ALN 组的子宫与Sham 组的子宫有显著性差异。其它器官系数结果并未发现差异；对于新鲜剥离的脏器组织，先经肉眼仔细观察组织的颜色、状态、形状和大小，通过对比Sham组，可以明显的发现ALN 组和OVX 组子宫明显的萎缩，这是因为小鼠的卵巢切除后OVX 组由于雌激素缺乏造成的子宫萎缩，其它器官对比并未发现明显差异点。脏器病理切片直观反映了微观组织的真实状态，显微镜下观察各脏器的病理切片，发现各组小鼠的各个器官除了ALN 组和OVX 组的子宫内膜组织腺体稀少并且萎缩变薄，其它器官均未见明显病变。从脏器系数与脏器病理切片结果可以看出，ALN 未给切卵巢小鼠的生长产生不良影响，也未带来明显的毒副作用，证实了ALN 作用于切卵巢小鼠的安全性。

骨组织脱钙是指将骨组织中的有机成分和骨盐进行分离，通过物理或者化学的方法，去除钙盐得到完整的胶原纤维组织和基质［13］，组织会变软从而方便制片和染色。EDTA 是一种比较理想的螯合脱钙剂，不仅对组织结构和细胞形态影响较小，而且还可以保存组织中的抗原物质和某些酶类的活性［14］。10% EDTA 脱钙液脱钙后的骨组织行HE染色效果佳，且不易掉片。骨质疏松会引起骨髓腔内脂肪细胞的增多，脂肪细胞与成骨细胞属于竞争性抑制的关系，脂肪细胞越多骨量就越少［15］。从脱钙骨组织切片可以看出OVX 组的骨髓腔脂肪较多，骨小梁稀疏，ALN 组的骨髓腔脂肪细胞较少并且骨小梁比较致密，说明ALN 可以有效的提高骨量。

Micro CT 是骨组织微观结构鉴定的新方法，可以从三维层面精准的反映皮质骨与松质骨的微结构［16］。Micro CT 有直观、准确和灵敏度高等特点，是骨科基础疾病研究常用的一种有效的可靠手段，特别在骨质疏松症相关的大小鼠实验中运用最多。本次以实验小鼠股骨为对象，分析最大剖面图与立体三维重建图，通过二维和三维的角度分析小鼠股骨的微观结构并得到准确的松质骨和皮质骨量化指标结果。直观体现松质骨和皮质骨的微观构造，同样得到皮质骨和松质骨量化数值。Micro CT 结果显示，ALN 都能增加骨小梁数量、加大骨小梁厚度、减小骨小梁间距、加强骨小梁的连续性，使得松质骨内部的骨小梁更加紧致，在微观层面加强骨质量并提高骨强度。说明ALN 可以预防小鼠切卵巢引起骨的丢失，增加骨质量。

骨生物力学是从物理力学角度评价骨质量的一种方法［17］，指在外界受力情况下，骨组织所呈现出的生物力学特性。骨生物力学能真实反映骨骼的强度与韧性，判断骨骼的抗骨折能力。骨生物力学性能的改善也能代表骨质量的好转。在PMOP的小鼠实验中，常用的生物力学指标包括最大载荷和弹性模量。从弹性模量和最大载荷数值的大小可以判断骨组织强度的大小、韧性的好坏。本次研究对实验小鼠L4 锥体进行了压缩实验。结果显示，ALN 组的L4 锥体生物力学性能显著高于OVX 组，这是由于小鼠卵巢切除后雌激素不能产生，从而导致椎骨的生物力学下降。

骨代谢本质是通过血清生化指标反映的［18］，是观察体内代谢情况的窗口，直观反映骨形成情况与骨吸收情况，客观评价骨代谢活动和骨转换率。血清骨代谢生化指标由骨形成指标与骨吸收指标组成，常见的骨形成指标包括OCN 和PINP，骨吸收指标包括TRACP-5b 和CTX-I。骨形成指标的高低代表了骨形成作用的高低，骨吸收指标的高低代表了骨吸收作用的高低。骨形成指标含量增高而骨吸收指标含量减少时，新骨基质的生成速率高于旧骨基质的吸收。骨形成指标含量减少而骨吸收指标含量增多，说明新骨基质的形成并不能及时填补旧骨基质的吸收。在血清生化指标检测结果发现OVX 组骨形成降低而骨吸收增加，证明了PMOP 模型的造模成功。测量结果表明，ALN 能抑制OVX 小鼠的破骨细胞活性来抑制骨吸收。

综上所述，阿仑膦酸钠可通过提高小鼠骨密度、优化骨微结构、提高骨强度、促进骨形成、抑制骨吸收来减少因切卵巢引起的骨质量流失，并且对小鼠的脏器具有一定安全性，无明显的副作用。本研究结果表明，阿仑膦酸钠可以有效的治疗切卵巢引起的骨质疏松，为阿仑膦酸治疗骨质疏松和安全性提供了新的理论依据。

作者贡献度说明：

王龙飞：课题设计、动物饲养、实验操作、数据采集、论文撰写、论文修改；高玉海、 杨世超：实验操作、数据采集；黄睿馨、李幸、杨玉田、轩莹莹、唐汉琴：实验操作；陈克明：研究指导、论文校审。

所有作者声明不存在利益冲突。