西药联合温和灸对甲状腺功能减退大鼠模型干预作用的机制研究

王红阳，孙佳姿，刘清清，闫 婧，张天生，郝重耀

（1.山西中医药大学，山西 晋中 030619；2.山西省针灸医院，山西 太原 030006）

甲状腺功能减退症（甲减）是一种由甲状腺激素含量不足导致的内分泌疾病，涉及多个器官系统。甲减的发病率正逐渐升高［1］。甲减的发病原因复杂，与免疫及机体的碘含量［2］等多种因素相关。甲状腺自身抗体是甲减发病的影响因素之一，其检出率女性高于男性［3］，甲减的发病率女性较高也与此有关。甲减已被发现与多种疾病相关［4-6］。最新研究还发现甲减与新冠的病情预后存在相关性［7］。甲减的临床治疗多采用激素替代法。激素替代治疗因个体差异大，药量控制难［8］，且研究表明激素替代治疗可增加甲减患者心血管疾病及骨质疏松症的患病风险［9］。课题组前期研究表明麦粒灸可调节甲减大鼠海马乙酰胆碱含量［10］、抑郁状态［11］、调节免疫失衡［12］，本实验进一步探究艾灸对甲减的可能干预机制。麦粒灸操作难度大，存在推广局限。本实验通过观察西药加温和灸对甲减模型大鼠血清甲状腺过氧化物酶抗体（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）、甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulin antibody，TGAb）、白 细 胞 介 素4（interleukin-4，IL-4）、白细胞介素23（interleukin-23，IL-23），甲状腺组织钠碘共转运体（na/I symporter，NIS）的含量，及甲状腺组织NISmRNA 表达量，探究西药联合温和灸对甲减的干预作用，及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级8 周龄SD 大鼠32 只（雌雄各半），体质量（180±20）g，购自北京市昌扬西山养殖场，许可证号SCXK（京）2019-0010。温度（25±1） ℃，湿度（48±2）%，光照12 h，自由饮食饮水。将大鼠适应性喂养7 d 后，随机分为4 组，分别为：空白组、模型组、西药组、西药加温和灸组，每组8 只。实验操作经山西省针灸研究所动物伦理委员会审批（批准号：伦审科2020 第003 号）。

1.2 主要仪器

37 度 酶 标 仪 Rayto RT-6100 450 nm 波 长 微 量高速离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司TG16W

台式高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司 TGL16M 120 g/0.1 mg 电子分析天平 上海良平生产 AE1204 电子分析天平 瑞士PRECISA生 产 XB220A 细 胞 破 碎 仪 EasyWeLL 系 列JY98-IIIN 正置显微镜 OLYMPUS 公司CX41 恒温烘箱 上海恒一科学仪器有限公司 低温冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司 TG-16M 移液枪吉尔森P 型移液器公司 青浦泸西仪器厂K30 电动匀浆机 FLUKO 公司 PRO200

1.3 主要试剂

大鼠白细胞介素23（IL-23）ELISA 试剂盒 WKSUbio 20210810 大鼠白细胞介素4（IL-4）ELISA 试剂盒 WKSUbio 20210710 大鼠免疫球蛋白G4 ELLSA 试 剂 盒 WKSUbio 20210826 大 鼠TSH ELISA 检测试剂WKSUbio 20210623 大鼠FT3 ELISA 检测试剂盒 WKSUbio 20210705 大鼠FT4 ELISA 检测试剂盒 WKSUbio 20210705 石蜡 上海国药集团 69018961 甲醛 上海国药集团 10010018二甲苯 上海国药集团 10023418 无水乙醇 上海国药集团 10092680 30%H2O2 上海国药集团10011218 广谱二抗 上海长岛生物技术有限公司D-3004 DAB 浓缩型试剂盒 上海长岛生物技术有限公司FL-6001 苏木素 厂家BASO 714094 中性树脂wksubio PAB180017 PCR 试 剂 盒 SYBR Green Thermo #K0223 逆转录试剂盒 Fermentas #K1622氯仿 国药集团 10023419 异丙醇 国药集团80109218 Trizol invitrogen 1596-026 水合氯醛 天津市科密欧化学试剂有限公司 4%多聚甲醛 大连美仑生物技术有限公司

1.4 药品

丙硫氧嘧啶片（上海复星朝晖药业有限公司，H31021082，50 μg；规格：50 mg/片）；左旋甲状腺素钠片（德国默克公司， H20140052；规格：50 μg/片）

1.5 造模

参考刘洲君［13］的造模，除空白组外其余各组均采用10% 丙硫氧嘧啶（PTU）溶液按10 mL/kg 体重的剂量每日灌胃，以制备甲减模型；每周记录大鼠体重以调整灌胃剂量。灌胃4 周后尾静脉取血，检测各组大鼠血清中TSH、TT4 的值，与空白组相比其余组出现TSH 含量上升，TT4 含量下降，即可判断为模型建立成功［14］。为维持大鼠甲减状态，造模成功后除空白组外的各组依然用PTU 溶液灌胃，频率改为隔日一次直到实验结束。

1.6 干预措施

空白组：不做处理。

模型组：与西药加温和灸组同方式，同频率固定。

西药组：左甲状腺素钠混悬液60 μg/kg 每日灌胃；与西药加温和灸组同方式、同频率固定。

西药加温和灸组：左甲状腺素钠混悬液60 μg/kg 每日灌胃。固定大鼠，参照《实验针灸学》［15］，取大鼠的大椎、命门、脾俞、肾俞，温和灸以上各穴，艾条垂直于穴位上2-3 cm 每穴灸10 min，治疗每6 日休息1 日，共治疗4 周。

1.7 数据收集

末次干预后大鼠禁食不禁水24 h，以10%水合氯醛按3.5 mL/kg 体重腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，静置1 h，3000 rp/min 离心机中离心10 min，取上层血清封存后，于-80℃冰箱中保存，待测。

大鼠处死后，割开颈部皮肤，剥离颈部肌肉及筋膜组织，暴露甲状腺，取左侧甲状腺组织于10%多聚甲醛溶液中，常温保存；右侧甲状腺组织，于冻存管中-80℃冰箱保存，待测。

1.8 指标检测

1.8.1 血清中相关指标测定 将大鼠血清按ELISA 试剂盒要求逐步检测，最终检测450 nm 波长处的OD 值，检测各组大鼠血清中TSH、TT4、TGAb、TPOAb、IL-4、IL23 含量。

1.8.2 甲状腺组织中NIS 免疫组化测定 于10%多聚甲醛中取出甲状腺组织，经固定-洗涤与脱水-透 明-浸 蜡-包 埋-切 片 后，进 行 染 色，脱 蜡-水化-抗原修复-阻断-封闭-PBS 清洗-脱水-透明-封片，镜下图像采集。

1.8.3 甲状腺组织中NISmRNA 的基因表达测定具体操作方法如下：取出冻存管中的甲状腺组织后，匀浆，反转录，扩增，引物序列见表1，观察溶解曲线确定其特异性，以GAPDH 为内参基因，空白组为对照组，用2-ΔΔCt计算相对表达量。

表1 PCR 引物序列Tab 1 Primer sequence of PCR

1.9 统计分析

采用SPSS 26.0 统计软件对数据进行分析，数据以均数±标准差（±s）表示，数据符合正态分布，方差齐采用单因素ANOVA 进行分析、两两比较用LSD 检验，方差不齐，用塔姆黑尼检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 西药加温和灸对各组大鼠甲状腺功能的影响

干预前，与空白组比较，其余各组大鼠血清中TSH 含量上升，TT4 含量下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；干预后，与空白组比较模型组大鼠血清中TSH 含量上升，TT4 含量下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较西药组及西药加温和灸组大鼠血清中TSH 含量下降，TT4 含量上升，差异有统计学意义（P＜0.01）；与西药组比较，西药加温和灸组大鼠血清中TSH 含量下降，TT4 含量上升，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清中TSH、TT4 含量变化（n=8）Tab 2 Changes of serum TSH and TT4 contents of rats in each group（n=8）

2.2 西药加温和灸对大鼠甲状腺自身抗体含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清中TPOAb、TGAb 含量上升，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较西药组及西药加温和灸组大鼠血清中TPOAb、TGAb 含量下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；与西药组比较，西药加温和灸组大鼠血清中TPOAb、TGAb 含量下降，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠干预前后血清中甲状腺自身抗体含量（n=8）Tab 3 Serum thyroid autoantibodies in each group before and after intervention （n=8）

2.3 西药加温和灸对各组大鼠甲状腺细胞因子表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清中IL-4 含量下降，IL-23 含量上升，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较西药组及西药加温和灸组大鼠血清中IL-4 含量上升，IL-23 含量下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；与西药组比较，西药加温和灸组大鼠血清中IL-4、IL-23 含量上升，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 各组大鼠血清中细胞因子含量变化（n=8）Tab 4 Changes in serum cytokine content of rats in each group （n=8）

2.4 西药加温和灸对各组大鼠甲状腺组织中NIS含量的影响

NIS 的阳性染色呈棕黄色，主要分布于甲状腺滤泡细胞胞膜上。图片中空白组及西药加温和灸组染色较深，分布范围广，西药组染色相对较浅，分布范围广；模型组染色浅，分布范围。见图1。

与空白组比较，模型组大鼠甲状腺组织中NIS的含量下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较西药组及西药加温和灸组大鼠甲状腺组织中NIS 的含量上升，差异有统计学意义（P＜0.01）；与西药组比较，西药加温和灸组大鼠甲状腺组织中NIS 的含量上升，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表5 各组大鼠NIS 平均灰度值比较（n=4，±s）Tab 5 Comparison of average gray values of NIS in each group （n=4，±s ）

表5 各组大鼠NIS 平均灰度值比较（n=4，±s）Tab 5 Comparison of average gray values of NIS in each group （n=4，±s ）

注：与空白组比较，1）P＜0.01;与模型组比较，2）P＜0.01;与西药组比较，3）P＞0.05。

IOD 值32.78±0.56 19.67±5.851）35.85±0.802）33.08±1.512）3）22.465 0.000组别空白组模型组西药组西药加温和灸组FP

2.5 西药加温和灸对各组大鼠甲状腺组织中NISmRNA 表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠甲状腺组织中NISmRNA 的含量下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较西药组及西药加温和灸组大鼠甲状腺组织中NISmRNA 含量上升，差异有统计学意义（P＜0.01）；与西药组比较，西药加温和灸组大鼠甲状腺组织中NISmRNA 含量上升，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表6。

表6 各组大鼠甲状腺组织NISmRNA 相对表达量Tab 6 Relative expression of NISmRNA in thyroid tissue of rats in each group

3 讨论

甲减的发病与多种疾病相关，其发病率的逐渐升高，对机体伤害较大。甲减还与妊娠及新生儿生长发育关系密切［16，17］。甲减的治疗目前多针对其激素缺乏的病因采用激素替代治疗。激素替代治疗疗效好，但依从性差［18］，且治疗的药物用量难以把控［19］，易增加副作用产生率。针灸治疗甲减疗效好［20］，优势明显。艾灸对甲减的干预作用显著，可有效解决激素替代治疗中的问题。为甲减的临床治疗提供新的选择。艾灸对于甲减的治疗遵循中医理论指导，从甲减脾肾阳虚的病机［21］角度出发，选用脾俞、肾俞、大椎、命门补益脾肾之阳。温和灸操作简单，易推广。

免疫系统功能紊乱是甲减发病的原因之一。甲状腺自身抗体含量上升是甲减发病的重要免疫系统表现。TPOAb 和TGAb 是甲状腺的自身抗体，可抑制甲状腺功能［22］。调节免疫是甲减的干预机制之一［23］。IL-4、IL-23 分别是Th2、Th23 产生的细胞因子。IL-4 的含量一定程度上可预测甲减的严重程度［24］。甲减发病与IL-23 含量变化相关［25］。甲 减 患 者 的IL-23/IL-23R/Th17 细 胞 轴 增 强［26］。研究结果显示，西药组及西药加温和灸均可降低大鼠血清中TSH、TPOAb、TGAb、IL-23 的含量（P＜0.01），升高TT4、IL-4 含量（P＜0.01），可见西药及西药加温和灸组对甲减模型大鼠干预作用确切，可调节甲减模型大鼠的免疫因子含量，调节免疫平衡。

碘是甲状腺激素合成的重要原料。甲状腺细胞对于碘的摄取能力与甲状腺激素的分泌直接相关。NIS 是碘向细胞内转运的一种糖蛋白，甲状腺细胞上碘的转运依赖于NIS 实现。NIS 在甲状腺组织中的含量，与甲状腺激素的产生量正相关。甲状腺组织中NIS 的含量与血清TGAb、TPOAb 含量存在相关性［27］。研究结果表明：西药及西药加温和灸可促进甲状腺组织中NISmRNA 的表达；且西药加温和灸组效果优于西药组（P＜0.05）。免疫组化结果进一步验证了这一结论。说明西药加温和灸具有干预甲减模型大鼠，其增强甲状腺组织中NISmRNA 表达的作用优于西药。

4 结论

西药联合温和灸可以调节甲减大鼠的免疫系统，降低TPOAb、TGAb、及IL-23 的含量，升高IL-4的含量，促进甲减大鼠甲状腺组织中NIS 的基因表达，增加NIS 的含量。这与炎性因子对NIS 具有调节作用的研究结果一致，IL-4 过表达的小鼠可代偿由碘缺乏导致的甲减，IL-4 过表达小鼠的甲减可由补 碘 解 决［16］。这 可 能 说 明IL-4 与NIS 表 达 间 存 在双向调节关系，有待进一步研究。另外在本实验中研究发现西药加温和灸对甲减模型大鼠的干预作用更显著，但其效果与西药组相比并不明确，只在对NISmRNA 表达的促进上更加确定（P＜0.05），其原因可能与本实验样本量较小，或温和灸刺激量小相关，有待进一步探究，以确定温和灸与西药是否具有协同作用。

作者贡献度说明：

张天生：对实验进行设计；郝重耀：技术指导，文章审校；王红阳，孙佳姿，刘清清，闫婧：负责药物干预，指标检测，数据分析；王红阳：执笔撰写论文。

所有作者声明不存在利益冲突关系。