tRNA-ValAAC-5 促进肝癌细胞增殖和迁移作用机制研究

2023-03-18陈卜钰云虹渝

海南医学院学报 2023年4期

石慧，谭琰，陈卜钰，云虹渝，杨彦

（1.海南医学院第一附属医院消化内科，海南海口 570000；2.海南医学院第一附属医院肝胆外科，海南海口 570000）

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率每年以大约3%的速度增长。80%肝癌的组织学类型是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）。目前，肝癌的早期诊断困难，无明显症状，初治即为中晚期肝癌，没有有效的治疗手段，死亡率逐年增高［1-3］。因此，发现新的肝癌特异性靶标分子对HCC 的治疗，提高患者生存率具有重要意义。

tsRNA 是tRNA 衍生的一种新型调节性小非编码RNA，参与多种生理和病理过程［4，5］。tsRNA通常长度为18～40 个核苷酸，由前体tRNA 或成熟tRNA 产生。tsRNA 可分为3 个不同的类别，包括：前体tRNA 衍生的小RNA，其以3'末端的poly U 残基特征（3'U tRF）；成熟的tRNA 衍生的片段（tRF），常分为3 种亚型（5'tRF、3'tRF 和inter tRF）；tRNA半分子（tRH）。tsRNA 参与了肿瘤的发生和发展，研究发现tsRNA 在胃癌［6］和胆管癌［7］中表达失调；tRNA-ValAAC-5 来源的tRF-17 能够靶向凝血酶敏感蛋白（Thrombospondin-1， THBS1）抑制TGF-β 1/smad3 信号的活化，从而抑制乳腺癌的增殖和侵袭转移［8］。Zhu 等［9］的研究提示tRNA-ValTAC-3、tRNA-GlyTCC-5、tRNA-ValAAC-5 和tRNAGluCTC-5 在肝癌患者血浆外泌体表达显著升高，并可以作为肝癌新的诊断标志物；但未见tsRNA 参与肝癌进程的相关报道。

本研究通过检测不同肝癌胞株及人永生化细胞株中tRNA-ValAAC-5 的表达差异，通过特异性性抑制剂干预tRNA-ValAAC-5 生物作用，研究tRNA-ValAAC-5 的表达对肝癌细胞增殖及侵袭转移的影响，为治疗肝癌提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人正常细胞肝细胞系（THLE2，THLE3）和HCC 细胞株（Hep3B， HuH7， SNU398， Hep3G2）均由上海冠导生物工程有限公司提供，由本实验室保存。tRNA-ValAAC-5 检测引物及tRNA-ValAAC-5-inhibitor/tRNA-NC 由上海生物工程有限公司合成；EntransterTM-R4000 转染试剂由北京英格恩生物科技有限公司提供；鼠抗人p21、MMP2、MMP9 抗体，GAPDH 抗体和HRP 标记二抗购自美国CST 公司；RNA 提取，反转录试剂盒，qPCR 检测试剂盒购自中国大连Takara 分公司；BCA 蛋白浓度测定、ECL 化学发光试剂盒、CCK-8 试剂盒（细胞增殖及毒性检测试剂盒）购自北京索莱宝科技有限公司；培养液RPIM 1640 和胎牛血清（FBS）购自美国GIBCO 公司。普通光学显微镜、数码显微摄影系统购自日本Olympus 公司；Varioskan LUX 多功能酶标仪购自赛默飞世尔科技；蛋白质印迹法电泳和电转仪器、ABI-7300 PCR 仪购自美国 Bio-Rad 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组人肝永生化细胞系（THLE2，THLE3）和HCC 细胞株（Hep3B， HuH7，SNU398， Hep3G2）由本实验室保存；细胞置于37 ℃水浴解冻，离心收取细胞，10%FBS 的RPIM 1640 培养液重悬、5%CO2、37 ℃温箱中培养，每24 h换液，细胞呈单层贴壁生长，待细胞长满后，0.25%胰蛋白酶消化传代培养。细胞传代至24 孔板中，细胞长至30%～40%时进行细胞转染。依照试剂盒操作说明使用EntransterTM-R4000 进行转染，Hep3B， Hep3G2 细胞分别转染50 pmol tRNA-ValAAC-5-inhibitor /tRNA-NC，分别命名为inhibitor组和NC 组。转染24 h 后，Real-time PCR 检测对tRNA-ValAAC-5 的干预作用。

1.2.2 Real-time PCR 检测tRNA-ValAAC-5 的表达按试剂说明书提取细胞总RNA，经测定A260/A280 在1.8～2.0 之间。按说明书进行逆转录获得cDNA，20 μL 逆转录反应体系包括：MMLV （200 U/μL） 0.2 μL， RT primer （1 μmol/L） 1.2 μL，dNTP（10 mmol/L） 0.75 μL， 5×RTBuffer 4 μL，RT primer （5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTC CGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGGCG AA-3’）。反应条件：37 ℃，30 min；85 ℃，10 min。

Real-time PCR 反应体系为20 μL，包括：cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，SYBR GREEN Master Mix 10 μL，同时设阴性对照。引物：forward-tRNA-ValAAC-5（5’-GAGGACGTTTCCGTAGTGTAGTGG-3’）， reversetRNA-ValAAC-5（5-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3’）；forward-U6 （5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3）、reverse-U6 （5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3）；反应条件为：95 ℃ 15 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 3 min，40 个循环。实验设3 个复孔，反应结束后计算机自动分析出定量结果。

1.2.3 细胞增殖能力检测传代培养Hep3B，Hep3G2 细胞转染tRNA-ValAAC-5-inhibitor/tRNA-NC 后细胞24 h，收集细胞计数，96 孔板每孔接种5 000 个细胞，接种后的24、48、72、96 h 除去细胞培养上清，按照CCK-8 检测试剂盒说明书操作，于570 nm 处酶标仪读取吸光度（A 值），并绘制生长曲线。1.2.4 Transwell 法检测细胞侵袭能力变化Hep3B， Hep3G2 细胞传代培养，细胞贴壁过夜，转染tRNA-ValAAC-5-inhibitor/tRNA-NC 后24 h，收集细胞计数，按照每孔2×105个细胞平铺于Transwell 小室（有基质胶）。24 h 后取出Transwell 小室，用棉签擦去上室内的细胞和基质胶，将小室置于0.1%结晶紫染色，显微镜进行观察统计小室底部的细胞数，并拍照。

1.2.5 蛋白质印迹法检测p21、MMP2、MMP9 蛋白表达 Hep3B， Hep3G2 细胞传代培养， tRNA-ValAAC-5-inhibitor/tRNA-NC 转染后48 h 收集细胞，预冷PBS 洗2 遍，置于冰上，加入400 μL NP-40 裂解液后重悬细胞，冰上放置30 min 后，4 ℃离心机，12 000 r/min 10min，取上清液，BCA 蛋白定量试剂盒法检测蛋白浓度。水煮制备样品后，上样（每孔20 μg 蛋白），依次10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、5%脱脂奶粉封闭、p21、MMP2、MMP9一抗（1∶2 000） 4 ℃摇床孵育过夜，漂洗，二抗（1∶5 000）孵育30 min，漂洗后，ECL 显影并拍照，灰度扫描检测蛋白表达。

1.3 统计学处理

所有数据采用SPSS 22.0 进行统计学分析。所有计量资料以（±s）表示，符合正态分布的两组均值间比较采用t检验。检验水准α=0.05 （双尾），P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 tRNA-ValAAC-5 在HCC 细胞中的表达量高于正常细胞肝癌细胞系

HCC 细胞株（Hep3B， HuH7， SNU398，Hep3G2）和人正常细胞肝癌细胞（THLE2，THLE3）分别传代培养，收取6 孔板内对数生长期细胞检测tRNA-ValAAC-5 的表达。通Real-time PCR结果显示：以THLE2 细胞tRNA-ValAAC-5 的表达量为标准（1.000±0.003）， THLE3、Hep3B、 HuH7、SNU398、Hep3G2 细胞中tRNA-ValAAC-5 的表达相对表达量为1.005±0.014、2.799±0.171、1.884±0.080、1.363±0.054、2.185±0.117；与THLE2 细胞相比，Hep3B、HuH7、SNU398、Hep3G2 细胞表达显著升高，差异有统计学意义（n=3），P＜0.05。Hep3B 和Hep3G2 细胞，其相对表达量分别为THLE2 细胞的2.80 倍和2.18 倍，后续选择Hep3B 和Hep3G2 细胞用于实验（图1）。表明tRNA-ValAAC-5 在肿瘤细胞中高表达可能对增殖、侵袭转移等恶行表型发挥关键作用。因此，使用tRNA-ValAAC-5-inhibitor/tRNA-NC 分别转染Hep3B， Hep3G2 细胞干预tRNA-ValAAC-5，24h 后收集细胞检测得到与NC 组相比，inhibitor 组tRNA-ValAAC-5 表达显著降低（表1），表明转染成功，tRNA-ValAAC-5-inhibitor 干预有效。

表1 Hep3B、Hep3G2细胞tRNA-ValAAC-5的表达（n=3，±s）Tab 1 Expression of tRNA ValAAC-5 in Hep3B and Hep3G2 cells （n=3，±s）

注：与NC 组相比，**P＜0.01。

组别HuH7 1.03±0.04 0.29±0.02**27.45＜0.001 NC inhibitor t P tRNA-ValAAC-5 Hep3B 1.04±0.02 0.32±0.03**36.52＜0.001

图1 不同肝癌细胞系tRNA-ValAAC-5 的表达（n=3）Fig 1 Expression of tRNA ValAAC-5 in different hepatoma cell lines （n=3）

2.2 tRNA-ValAAC-5 对HCC 增殖的影响

Hep3B 和Hep3G2 细胞分别传代培养于6 孔板中，转染tRNA-ValAAC-5-inhibitor/tRNA-NC 24 h后收集细胞平铺于96 孔板中，CCK-8 法检测细胞增殖情况，结果见表2。得到转染inhibitor 组Hep3B 和HuH7 细胞增殖受到显著抑制，P＜0.01。表明tRNA-ValAAC-5 在HCC 细胞中高表达能有效促进细胞增殖。

表2 tRNA-ValAAC-5 对HCC 细胞Hep3B 和Hep3G2 增强的影响（±s）Tab 2 Effect of tRNAValAAC-5 on the proliferation of Hep3B and Hep3G2 cells in HCC（±s）

注：与NC 组相比，**P＜0.01。

组别Hep3B Hep3G2 96 h 1.65±0.09 1.30±0.05**7.59＜0.001 48 h 1.21±0.07 0.96±0.10**8.23＜0.001 48 h 1.22±0.07 0.98±0.09**5.11＜0.001 72 h 1.40±0.05 1.18±0.02**9.39＜0.001 NC inhibitor 72 h 1.31±0.06 1.05±0.05**7.33＜0.001 24 h 1.04±0.10 0.77±0.07**5.25＜0.001 96 h 1.55±0.06 1.13±0.02**14.16＜0.001 24 h 1.10±0.10 0.79±0.12**4.25＜0.001 t P

2.3 tRNA-ValAAC-5 对HCC 侵袭转移的影响

Hep3B 和Hep3G2 细胞分别传代培养于6 孔板中，转染tRNA-ValAAC-5-inhibitor/tRNA-NC 24h后收集细胞，Transwell 小室法检测对细胞侵袭转移能力的影响（图2）；得到结果见表3。与转染NC 组相比，inhibitor 转染Hep3B 和HuH7 细胞侵袭转移能力减弱，差异均有统计学意义（P＜0.001）。表明tRNA-ValAAC-5 在HCC 细胞中高表达促进细胞侵袭和转移。

表3 两组转染对Hep3B 和Hep3G2 细胞侵袭转移能力影响（n=5， ±s）Tab 3 Effect of tRNA ValAAC-5 on Hep3B and Hep3G2 cell invasion and metastasis（n=5， ±s）

注：与NC 组相比，**P＜0.01。

HuH7 153.2±8.8 59.8±3.8**21.85＜0.001组别NC inhibitor t P Hep3B 145.0±15.7 44.8±2.78**14.01＜0.001

图2 tRNA-ValAAC-5 抑制剂抑制细胞侵袭转移（结晶紫染色，×200）Fig 2 tRNA ValAAC-5 inhibitor inhibits cell invasion and metastasis （crystal violet staining， ×200）

2.4 tRNA - ValAAC - 5 表达对p21、MMP2 和MMP9 表达的影响

Hep3B 和Hep3G2 细胞分别传代培养于6 孔板中，转染tRNA-ValAAC-5-inhibitor/tRNA-NC 48 h后收集细胞，Western blot 法检测Hep3B 细胞和Hep3G2 中p21、MMP2 和MMP9 的表达（表4）。得到与NC 组相比， inhibitor 组Hep3B（图3）和Hep3G2（图4）细胞p21 表达升高，MMP2 和MMP9的表达均降低，差异有统计学意义（t=8.96、12.80、4.652，P＜0.01）、（t=15.17、22.36、12.61，P＜0.01）。表明tRNA-ValAAC-5 在HCC 细胞中高表达可以参与调控p21、MMP2 和MMP9 的表达。

表4 两组转染对Hep3B 和Hep3G2 细胞p21、MMP2 和MMP9 的表达影响（n=5， ±s）Tab 4 Effect of tRNA ValAAC-5 on the expression of p21， MMP2 and MMP9 in Hep3B and Hep3G2 cells（n=5， ±s）

与NC 组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别Hep3B Hep3G2 MMP9 0.96±0.04 0.47±0.068*12.61＜0.001 MMP2 0.62±0.03 0.20±0.02**22.36＜0.001 tP MMP9 1.24±0.20 0.64±0.09**4.652＜0.001 p21 0.35±0.04 0.66±0.05**8.96＜0.001 MMP2 0.60±0.05 0.22±0.02**12.80＜0.001 p21 0.33±0.02 0.62±0.03**15.17＜0.001 NC inhibitor

图3 tRNA-ValAAC-5 抑制剂对Hep3B 细胞p21、MMP2 和MMP9 表达影响（n=3）Fig 3 Effect of tRNA ValAAC-5 inhibitor on the expression of p21， MMP2 and MMP9 in Hep3B cells （n=3）

图4 tRNA-ValAAC-5 抑制剂对Hep3G2 细胞p21、MMP2和MMP9 表达影响（n=3）Fig 4 Effect of tRNA ValAAC-5 inhibitor on the expression of p21， MMP2 and MMP9 in Hep3G2 cells （n=3）

3 讨论

由于肝细胞癌发病隐匿，导致患者确诊时多数已是中晚期，基本失去了手术治疗、肝移植的机会。探索肝癌生长，转移的新机制对肝癌的早期诊断与治疗具有积极意义。小RNA 在调控肝癌进展中发挥关键作用。tsRNAs 被认为是一种新型的、潜在的非编码RNA（ncRNAs），它参与多种细胞过程，并在癌症进展中发挥重要作用［5，10］。本研究中，我们通过检测不同HCC 细胞中tRNA-ValAAC-5 表达，并干扰其在Hep3B 和Hep3G2 的表达，发现其在HCC 中高表达促进细胞增殖和侵袭转移，并调控p21、MMP2 和MMP9 的表达。

tsRNA 以前被认为是tRNA 的随机降解产物，没有生物学作用。但近年来将归类为一类重要的功能性小非编码RNA；能够以microRNA 的方式发挥特定的生物学作用。如tsRNA 参与RNA 干扰，调节目标mRNA 的稳定性，改变胚胎转录级联调控，作为父本表观遗传因子介导代谢疾病遗传；作为蛋白结合因子，tsRNA 与细胞色素C 互作调控细胞凋亡等［11-13］。相关报道指出乳腺癌患者癌组织样本中tsRNA-26576 高表达［14］，tsRNA-26576 抑制MDA-MB-231 细胞细胞凋亡的同时，能促进细胞增殖和迁移；mRNA 测序结果显示，在MDA-MB-231细胞中提供tsRNA-26576 抑制剂后，包括FAT4 和SPEN 在内的几个抑癌基因表达升高。因此，tsRNA-26576 可以作为乳腺癌的潜在临床治疗靶点和预测标记。转录因子Runt-特相关的转录因子1（RUNX1）是乳腺上皮中的抑癌基因，RUNX1 下调节与乳腺癌的启动和进展相关；研究者发现tsRNA（ts-19、ts-29、ts-46 和ts-112），它们能有效抑制RUNX1 的生物学作用；ts-112 和RUNX1 在正常样乳腺上皮和乳腺癌中表达负相关，Ts-112 促肿瘤相关活性和RUNX1 的肿瘤抑制活性一致。在侵略性乳腺癌细胞MCF10CA1a 中抑制ts-112 可显著减少增殖，ts-112 在正常上皮MCF10A 细胞的异位表达显著增加增殖。这些发现支持了ts-112 的致癌潜力［15］。慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者是白血病最主要的类型，研究者调查了CLL 样本和健康对照中tRNA 的tRF-5 片段的表达水平，发现tRF-5 在CLL 中与正常对照相比降低了5 倍［16］。本研究发现肝癌细胞中tRNA-ValAAC-5 表达量显著高于正常对照细胞，其中Hep3B 和Hep3G2 表达最高，这可能与不同来源的肿瘤细胞恶性程度有关。此外通过使用inhibitor 干预tRNA-ValAAC-5 发挥作用，得到tRNA-ValAAC-5 在肝癌中高表达发挥促癌作用，能够有效促进细胞增殖，侵袭和转移。这也与前期文献［9］报道的肝癌患者外泌体中tRNA-ValAAC-5升高，并作为肝癌早期诊断指标具有一致性。基于肝癌细胞中tRNA-ValAAC-5 的表达，提示我们tRNA-ValAAC-5 除促进肝癌细胞自身的增殖，侵袭和转移外，亦可能通过远端调控肿瘤的微环境，加速肝癌的全身性转移。

细胞周期负调控因子p21 能够有效抑制细胞周期G1-S 期的转化，p21 作为重要的抑癌基因，p21 表达升高抑制细胞增殖［17，18］。MMPs 在肿瘤间质中表达水平与肿瘤的侵袭转移密切相关，TIMP3 结合具有酶活性MMPs 并抑制MMPs 降解ECM［19］。本研究结果显示，在抑制tRNA-ValAAC-5 表达的基础上，p21 的表达显著升高，MMP2 和MMP9 的表达降低；提示tRNA-ValAAC-5 调控肝癌细胞增殖可能调控细胞周期有关，并通过影响MMP2 和MMP9 的表达调控细胞侵袭和转移。

综上所述，肝癌细胞中tRNA-ValAAC-5 表达沉默后，细胞增殖，侵袭和转移能力受到抑制；tRNA-ValAAC-5 可能通过调控p21、MMP2 和MMP9 的表达影响细胞周期和细胞的转移。本研究存在一定的不足之处，只进行了体外细胞实验，没有证实tRNA-ValAAC-5 的直接作用靶点；接下来将通过动物实验探讨tRNA-ValAAC-5 体内肝癌生长的影响及tRNA-ValAAC-5 发挥作用的具体机制；以期进一步阐明肝癌发生，发展的机制，为肝癌的治疗提供新途径。

作者贡献度说明：

石慧：参与实验，收集整理数据及撰写论文；杨彦：课题设计和论文校审；其余作者：谭琰、陈卜钰、云虹渝：参与实验及管理报账。

所有作者声明不存在利益冲突关系。