从细胞凋亡角度探讨针刺干预蛛网膜下腔出血认知障碍的机制之研究进展

熊康 张美玲 王祯芝 方永军 胡珍渊 周锋

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是指颅内血管破裂,血液流入蛛网膜下腔的一种重型脑血管疾病。近期研究指出SAH和SAH术后常见认知功能障碍(cognitive impairment, CI),即使其他功能恢复良好的患者也常受此困扰,CI严重影响了生活质量、工作参与度与社会活动,不容忽视[1]。有研究证实SAH之后,海马、脑血管等组织发生了细胞异常凋亡情况[2-3]。亦有研究发现通过抑制细胞异常凋亡可以缓解SAH所致的CI[4]。由此可知细胞过度凋亡参与了SAH CI发生发展过程,为SAH CI的重要原因,并提示通过对细胞异常凋亡进行调控对于防治该病证具有重要意义。针刺能促进脑功能恢复,在脑卒中后遗症的防治方面有一定优势。本文从细胞凋亡相关通路角度来探讨针刺干预SAH CI作用机理,以期开拓基础研究思路,提升相关诊疗效果。

1 细胞异常凋亡与SAH CI的发生发展密切相关

SAH后,脑部微环境改变与微循环障碍会致使细胞中的线粒体、内质网等亚细胞器出现损害[5]。线粒体是细胞内的“动力车间”与能量转化、三羧酸循环、钙离子存储等密切相关,其在细胞凋亡中有着重要的作用。而持续或过度的内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)也可诱导细胞凋亡[6]。还有研究表明,SAH后脑血管组织中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)表达水平升高[7],TNF-α可诱发炎症反应,还可作为细胞外死亡配体与细胞表面相应的死亡受体结合,在细胞凋亡中亦扮演着重要角色。研究表明SAH所引发的细胞过度凋亡可能在SAH CI的发生发展中起重要作用[8]。一些信号通路也会直接或间接影响细胞凋亡相关因子,进而参与调控细胞凋亡过程。其中Janus激酶(Janus kinase,JAK)/信号转导和转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信号轴等与SAH CI发生发展过程中细胞凋亡有着紧密联系[9-10]。因此,细胞过度凋亡与SAH CI的发生发展密切相关,是SAH CI的紧要原因,这为防治SAH CI提供了线索。调控细胞凋亡能减缓脑组织损伤,或许可能达成有效治疗SAH CI的目的,是良性干预SAH CI的重要路径。

2 针刺调控线粒体凋亡通路研究进展

2.1线粒体通过多种途径影响细胞凋亡

线粒体膜通透性发生改变后,致使线粒体向细胞质释放一些蛋白,其中线粒体释放的细胞色素c(Cytochrome-c, Cyt-c)在细胞质中可激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)级联反应,引起细胞凋亡。部分研究发现SAH后脑组织中抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)表达水平降低,而促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bcl2-associated X,Bax)以及Caspase-3的表达水平升高[11-12],这提示总体上是促进了Cyt-c的释放。Cyt-c释放到细胞质溶质中后,会与凋亡蛋白酶激活因子-1以及Procaspase-9形成复合物,这种复合物会激活下游的Caspase-3等效应分子,致使细胞凋亡[13]。而线粒体释放出的这些蛋白中,除了Cyt-c之外,还有凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor, AIF),且其可通过非Caspase依赖细胞凋亡通路参与凋亡过程,亦能诱发细胞凋亡[14]。蒋崇贵等[15]研究发现SAH后应用Caspase抑制剂的实验组大鼠海马区AIF表达水平显著升高,提出当Caspase依赖通路被抑制时,SAH后早期细胞凋亡或许主要是由AIF途径介导的观点。所以Caspase依赖通路与非Caspase依赖通路均参与介导了SAH CI发生发展过程中的细胞凋亡,且二者间存在相互联系。

2.2针刺对线粒体源凋亡信号的控制作用

针刺能调节Bcl-2、Bax等的表达,控制Cyt-c和AIF从线粒体的释放以及后续凋亡进程,而减轻细胞过度凋亡程度。陈英华等[16]研究发现针刺血管性痴呆大鼠风池、四神聪,可以增加大鼠海马区Bcl-2表达,减少Bax表达,起到脑保护作用。SAH后由于脑部微循环障碍,导致脑血流量减少,脑功能损害加剧。针刺治疗可使经络疏通,气血调达,有利于消除血肿,减轻血管痉挛,调节脑灌注量,改善血液循环,韩佳炜等[17-18]在针刺对脑出血模型大鼠急性期血肿周围脑组织细胞凋亡的影响及相关机制的研究中发现,针刺人中和内关可显著改善脑出血模型大鼠神经功能缺损体征,减轻脑损伤,并且穴位组疗效显著优于非穴位组,相较于非穴位组大鼠,针刺水沟和内关的穴位组大鼠脑组织中Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3的表达水平显著降低,认为针刺人中和内关对脑出血的干预作用机制可能与调节Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3等表达,抑制脑出血后神经细胞过度凋亡有关,并提示穴位是影响针刺效应的重要因素之一。

因为AIF可通过非Caspase依赖途径,亦能介导凋亡发生,所以单纯靶向Caspase通路,或许并不能有效控制SAH CI发生发展过程中的细胞凋亡。近期有研究探讨针刺“百会”透“曲鬓”对脑出血大鼠脑组织中AIF表达的影响,发现针刺可改善急性期脑出血大鼠神经功能评分,有效抑制神经细胞异常凋亡,降低脑出血后血肿周围脑组织中AIF的表达水平[19]。该结果可为针灸治疗SAH CI提供新思路,由此也可见无论对于Caspase依赖凋亡通路还是非Caspase依赖凋亡通路,针刺均能够发挥调控效应。且从一定程度上亦反映了针刺疗法具有多靶点、多途径、多水平的整体调节特点。

而鲜有文献研究联合Caspase依赖途径与非Caspase依赖途径,探析针刺的干预效应,故深挖针刺疗法对二者的整合作用,颇具研究潜力。

3 针刺调控内质网凋亡通路研究进展

3.1内质网应激太过促使细胞凋亡

ERS可引发未折叠蛋白反应,之后启动跨膜蛋白激酶1(inositol-requiring enzyme 1, IRE1)、蛋白激酶R样内质网激酶(PKR-like ER kinase, PERK)、活化转录因子6(activating transcription factor 6, ATF6)介导的助细胞存活程序,而持续或剧烈的ERS则会激活与增强子结合蛋白同源蛋白(C/EBP-homologous protein, CHOP)、Caspase-12、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase, JNK)等相关的促细胞凋亡途径,且PERK、IRE1、ATF6等亦在ERS介导的促细胞凋亡通路中扮演重要角色[20-21]。相关研究显示,SAH后,脑组织中p-PERK的表达上调,且PERK之抑制可能通过Akt相关的抗凋亡途径抑制SAH后的细胞凋亡,减轻脑损伤[22]。这表明控制ERS,有益于减缓细胞凋亡情况,助力SAH CI的防治。

3.2针刺对内质网应激的制约作用

龚丽等[23]研究发现,针刺疗法可以对脑缺血再灌注受损脑组织起修复与保护作用,提高患鼠学习记忆等能力,蛋白免疫印迹法检测结果提示其机制可能与降低PERK、CHOP、Bax表达水平,提高Bcl-2与p-Akt表达水平,调控ERS相关的细胞凋亡通路有关,而且针刺疗法联合康复训练的治疗效果更佳。葡萄糖调节蛋白78是重要的ERS效应分子,其作为ERS标志物,可反映内质网功能状态。毛旭等[24]进行了针刺对阿尔茨海默病大鼠海马区神经元细胞内质网应激及凋亡的影响研究,发现针刺能够调控葡萄糖调节蛋白78、Caspase-12等分子的表达,降低细胞凋亡水平,表明针刺可控制ERS,调节内质网凋亡通路,有益于减缓认知障碍。至此可知针刺能够制约过度ERS,促进并维护亚细胞器稳态。

前已述及SAH后,多细胞器的结构与功能均发生改变,且与细胞凋亡有着紧密联系,因而值得深入研究针刺治疗SAH CI过程中,其对内质网、线粒体等亚细胞器良性干预的机制。

4 针刺调控死亡受体凋亡通路研究进展

4.1死亡配体受体相合引发细胞凋亡

细胞外死亡配体与细胞表面相应的死亡受体结合可引发一系列生物效应。TNF-α是一类多向性细胞因子,作为死亡配体与其受体结合后,能促使Caspase-8、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、鞘磷脂酶等的激活,可引致细胞凋亡[25]。这些因子也会互相作用,互相影响,如鞘磷脂酶有利于NF-κB的活化,NF-κB又可以促进TNF-α的基因转录,并且影响TNF-α的作用,NF-κB也能够调节Caspase家族、Bcl-2家族等的表达,对于细胞凋亡,NF-κB可能具有双向调节作用[26-27]。研究显示SAH患鼠脑组织中的TNF-α、Bcl-2、Caspase-3等分子水平发生显著改变,并伴随有神经细胞过度凋亡情况,临床也发现SAH患者脑脊液中白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、TNF-α的水平明显升高,并与SAH的预后息息相关[28]。因此,调节TNF-α等的表达可能有益于防治SAH CI。

4.2针刺对死亡受体凋亡通路的调节作用

目前针灸疗法在调控死亡受体凋亡通路方面的研究已取得一定进展。有研究通过制造脑缺血再灌注损伤模型,治疗予以电针百会和大椎,运用免疫组化、蛋白免疫印迹等方法观测大鼠皮质半暗区目的蛋白表达,发现电针能调节NF-κB和TNF-α的表达,有效减轻脑部炎症反应,同时显著抑制皮质半暗带TNF-α介导的相关细胞凋亡通路表达,减少神经细胞损失[29]。此外,杨超等[30]研究发现血管性痴呆大鼠模型血清中TNF-α含量增高,而针刺血管性痴呆大鼠百会、四神聪、大椎,可显著减少患鼠TNF-α的释放,改善神经精神症状,助力脑功能恢复。故可推测针刺防治血管性认知障碍的机制可能与调控TNF-α介导的炎症反应和细胞凋亡有关。

结合前述还可看出NF-κB、IRE1、ATF6等可能对凋亡具有双面效应,对于双面因子,因其在凋亡中的作用模式较复杂,故针刺在调控细胞凋亡过程中,对分子之表达以及其具体所显作用的影响尚需进一步研究,可以丰富针刺作用的双向性在分子生物学方面的涵义。

5 针刺调控相关信号通路研究进展

庞金伟等[31]研究发现SAH之后,出现了JAK2/STAT3信号通路活化,以及过度凋亡情况,而抑制JAK2/STAT3信号通路后,IL-1β、IL-6、TNF-α等因子表达水平降低,细胞异常凋亡情况亦显著缓解,提示SAH后JAK2/STAT3信号通路参与了早期脑损伤的病理过程。面对脑部微环境恶化,针刺能够影响信号分子表达,有益于机体稳态的促进与维持,韩德雄等[32]电针脑缺血再灌注模型大鼠百会穴与内关穴,采用TUNEL法检测神经元凋亡情况,RT-PCR技术检测JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达情况,发现电针可以抑制脑损伤过程中的神经元过度凋亡,发挥保护脑组织,改善神经功能的作用,其机制与针刺对JAK2/STAT3通路进行调控密切相关。

包括ERK1/2、JNK等在内的MAPK信号通路参与调节细胞的增殖、分化、凋亡等多种重要的生理病理活动。其中ERK信号通路可能通过影响p53的磷酸化,参与调节SAH后海马区神经元凋亡,而通过改变ERK通路活性,可减少神经细胞凋亡,并减轻SAH CI[33]。还有研究发现在SAH后脑损伤过程中,JNK信号通路和TNF-α可能会形成JNK-TNF-α反馈循环途径,JNK可能诱导TNF-α的表达,而TNF-α又会增强JNK的表达,从而诱导大脑皮层和海马区的细胞凋亡[34]。亦有研究显示SAH之后,海马区有异常凋亡情况,p-JNK、p-c-Jun及Caspase-3表达均上调,通过调控JNK/c-Jun信号通路可以抑制细胞凋亡,并且减轻SAH早期脑损伤[35-36]。林亚平等[37]研究发现针刺及亚低温均可以改善神经功能缺损,抑制细胞凋亡,对脑组织起保护作用,免疫组化、蛋白免疫印迹技术检测结果示其机制可能与调控ERK通路及改变Bcl-2表达水平和Bax表达水平有关,且针刺联合亚低温的疗效优于针刺或亚低温单独运用。朱雯等[38]取血管性痴呆大鼠百会、足三里进行针刺,结果显示针刺能够调节大鼠皮质中p-JNK表达,抑制神经元凋亡。因此,针刺可能通过影响凋亡相关分子间的反馈途径,来逆转加剧凋亡的恶性循环。

研究发现SAH后受损脑组织中成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)表达水平上升[39]。相关研究表明bFGF能够激活PI3K/Akt通路而促进细胞生存[40]。有研究显示SAH后海马和额叶皮质中Akt与ERK的磷酸化水平会有变动,提高其表达可以抑制细胞过度凋亡,减缓SAH CI,而且PI3K/Akt的保护作用部分是通过调节ERK通路而实现的[41]。还有学者认为SAH后激活了Akt信号通路,但该通路的活性不能维持以保护神经元细胞[42]。同时由于SAH损伤效应,bFGF的相对低表达,亦不能活化足够的PI3K等通路去启动有效的抗凋亡过程,使细胞修复能力不足,这就需要有效方法介导相关通路,从而起到对抗细胞过度凋亡,保护并修复神经元的作用。刘芳[43]进行了针刺治疗血管性认知障碍的动物实验研究,Morris水迷宫实验结果提示,电针百会、神庭能够显著改善患鼠的认知功能,TUNEL检测发现电针可以抑制患鼠神经细胞凋亡,实时荧光PCR和蛋白免疫印迹检测结果显示相较于模型组大鼠,电针组大鼠脑皮质组织中PI3K、p-Akt、Bcl-2表达显著上调,Bax表达显著降低。刘静[44]研究发现头针丛刺能够调节PI3K/Akt信号转导通路表达,减轻血管性痴呆大鼠神经元凋亡,从而减缓认知功能障碍,且头针丛刺联合运动训练疗效更佳。可见针刺疗法治疗血管性认知障碍,控制异常凋亡的机制与协调PI3K/Akt通路、MAPK通路、JAK/STAT等信号通路有关,并可结合其他疗法以协同增效。

6 结语和展望

综上所述,可见SAH引起的细胞异常凋亡是介导SAH CI发生发展的关键环节,且凋亡相关通路并非各自孤立,而是相互影响,相互沟通,显现出错综相连,而又精致细密的分子网络。CI是脑卒中的常见后遗症,世界卫生组织已提出“认知障碍是严峻的全球公共卫生与社会照护挑战”。而针对上述这些相关线索,开展多分子、多通路的实验尝试,可能会有利于针对SAH CI等疑难病症的有效治疗方法的发展。

关于SAH CI的治疗一直是临床难点,而目前,现代医学对SAH CI尚缺乏疗效确切的治疗方法。SAH CI属中医“中风”“健忘”“呆病”等病证范畴。《伤寒论》云“其人喜忘者,必有蓄血”,点明了该类疾病之病机,于《灵枢》中有“泻其有余,补其不足,阴阳平复,用针若此,疾于解惑”等针刺理法的相关记载。近些年来,也有研究证实针刺对蛋白分子有明确干预作用,且针刺在脑卒中后越早介入成效越好[45]。《素问》言“非其位则邪,当其位则正”,《类经》曰“气之在人,和则为正气,不和为邪气”,《医经秘旨》谓“治则为正气,不治则为邪气”。细胞凋亡本为维持内环境稳定的一种细胞死亡过程,属正气范畴,是机体正气功能的重要体现[46]。若其太过或不及则为邪矣,属于病理变化,会加重病理状态,甚或引起新的病变发生。中医针灸疗法注重守中致和,由前述可见对于异常细胞凋亡,针刺能够全面发挥良性调控效应,促使其向中正平和状态转化,可令其“改邪归正”。

且观上文可知SAH CI发生发展过程中,机体亦存在一定程度的调控凋亡等自身保护修复情况,然尚不足以扭转SAH损伤态势,故需和气扶正。经络即“气路”,与生理功能和病理变化等紧密相关,主管机体的生老病死,是生命自备的沟通上下内外、联系五脏六腑的调节控制系统,作用于经络腧穴的针刺疗法有调和阴阳、理气和血等功效,运用针刺疗法可以借助机体自身的经络系统,扶助机体自身的调节能力。从上述研究可推度针刺疗法良性干预SAH CI的机制可能与其调控凋亡相关通路,抑制细胞过度凋亡有关,且针刺疗法的疗效受穴位、时间、刺激方法等因素影响,这些都值得深入探究,此将有助于丰满针刺治疗SAH CI相关机理,为临床的及早与广泛应用提供更多支持,对脑血管疾病的积极防治,有效解决认知障碍这一难题意义重大。