慢性间歇性低氧对OSAHS大鼠心肌细胞焦亡的影响

李瑜，古丽娜孜·吐拉洪，陈玉岚，沙热扎提·依沙江，王蒙蒙，祖柏旦·阿布汉，阿丽亚·阿不力孜

1 新疆医科大学第一附属医院干部保健中心综合内二科，乌鲁木齐 830000；2 新疆医科大学第一附属医院心血管病中心高血压科；3 新疆维吾尔自治区人民医院高血压中心

阻塞性睡眠暂停低通气综合征（OSAHS）是一种常见的睡眠障碍，其特征是反复发生夜间低氧血症、高碳酸血症和短暂性觉醒［1］。慢性间歇性低氧（CIH）是OSAHS 最根本的致病因素。CIH 可通过多种生物学途径导致心血管功能异常［2-4］。在OSAHS小鼠模型中，阻塞性呼吸3 h 将会导致全身性炎症，心室中炎性细胞浸润显著增加［5］。研究显示，细胞焦亡是新发现的一种伴随炎症反应的细胞程序性死亡，在心血管疾病发生发展中扮演着重要角色［6］。细胞焦亡与CIH 诱导心肌损伤的关系目前尚不清楚。2021 年6 月—8 月，本研究通过观察OSAHS 大鼠左室心肌组织焦亡相关蛋白（Caspase-1、GSDMD、NLRP3）的表达变化，探讨CIH 对OSAHS 大鼠心肌细胞焦亡的影响。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 雄性SD 大鼠16 只，8～10周龄，体质量180～260g，由新疆医科大学动物实验中心提供，动物许可证编号：SCXK（新）2018-0003。常温下，普通饲料饲养，自由饮水及进食，造模前适应性饲养时间为1周。本研究经新疆医科大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准通过，审批号为IACUC-20210326-08。 Easy Ⅱ Protein Quantitative Kit （DQ111-01）购自北京全式金生物技术有限公司；RIPA裂解液（AR0105）、蛋白酶抑制剂（AR1178）购自武汉博士德生物工程有限公司；山羊抗兔IgG H&L（HRP）、山羊抗小鼠IgG H&L （HRP）购自英国Abcam公司；PVDFTransfer Membrane 0.45μm（ IPVH00010）购自美国Millipore 公司；Tris（A600194-0500g）、SDS（A100227-0500g）、丙烯酰胺（A501033-0500g）、双丙烯酰胺（A600025-0250g）购自德国Sangon Biotech 公司；GSDMDC1 抗体（sc-393581）购自美国Santacruz公司；EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-Low Rox（MasterMix-LR/1051845151001）、5X All-In-One RT MasterMix （with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）（G492）、TRIzol™ Reagent（15596026/229006）购自澳大利亚Abm 公司；M5 HiClear DL2000 DNA marker（MF025/18Ka2705）购自北京聚合美生物科技有限公司；琼脂糖（A610013-0250/A811BA0014）购自生工生物工程（上海股份有限公司）公司；DEPC（D60029-500ml/6635JK102）购自美国Amresco公司。重组Anti-pro Caspase-1+p10+p12 抗体［EPR16883］（ab179515）、重组Anti-NLRP3 抗体［EPR23094-1］ （ab263899）（ab282104）购自英国Abcam 公司。漩涡混合器（GL-88B）购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司；台式离心机（Neofuge）购自上海力申科学仪器制造厂；酶标仪（xMarkTM）购自Bio-Rad（中国）公司；化学发光成像仪系统（Chemiscope 3000）购自上海勤翔科学仪器有限公司；移液器（Dragon lab）购自德国Eppendorf 公司；蛋白转膜仪（Mini-PROTEAN Tetra system）、PCR仪购自美国Bio-Rad公司；电子天平（CP324S）购自德国Sartorius 公司；高速冷冻离心机（Heraeus Multifuge X1R）购自赛默飞世尔科技公司；微量分光光度计（Nano-100）购自杭州奥盛仪器有限公司；凝胶成像系统（2500）购自上海天能科技有限公司；Real Time PCR instrument（7500 Fast）购自美国ABI公司

1.2 动物分组、模型制备 适应性饲养1 周后将大鼠随机分为对照组、OSAHS 组各8 只。将OSAHS 组置于间歇性低氧舱，每天10：00—18：00 向舱内循环充入氮气（浓度99.9%）并排除混合空气。充入氮气90 s，当舱内氧浓度达6.5%时维持30 s，随后60 s排出舱内气体，氧浓度上升到21%持续60 s，为1 个循环，每天持续8 h［7］。对照组置于常氧舱内，提供常氧空气。8 周后注射氯胺酮将大鼠处死，开胸取出心脏，将心尖部组织用2.5%的戊二醛固定，用于扫描电子显微镜检测；将剩余心脏组织迅速放入液氮中。

1.3 心肌细胞超微结构变化观察 将新鲜左室心肌组织切下3 块（大小1 mm×5 mm），放置于预冷的2.5%戊二醛溶液中固定。4 ℃保存至少24 h 后取出，PBS冲洗3次，置于1%锇酸溶液中固定至少1 h，再次漂洗，逐级乙醇脱水，树脂包埋，常规超薄切片（8 nm），用4%醋酸双氧铀和0.4%柠檬酸铅固定，由新疆医科大学电子显微镜中心的专业人员制备样品，用扫描电子显微镜进行观察。

1.4 左室心肌组织中Caspase-1、GSDMD、NLRP3 mRNA 表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。取各组左室心肌组织约1 cm3置于预冷的冻存管，迅速置于-80 ℃冰箱保存。取大鼠左室心肌组织，液氮研磨，TRLzol 法提取总RNA，微量分光光度计测定RNA 浓度及260、280 nm 波长处吸光度值，RNA样本A260/A280在1.8～2.1。按照cDNA 反转录试剂盒说明书，将RNA 反转录为cDNA。将反转录得到的cDNA 置于-80 ℃保存。用实时荧光定量PCR 仪进行PCR 反应。反应体系：Eva Green2×qPCR MasterMix 10 μL，Forward Primer 0.6 μL，Reverse Primer 0.6 μL，cDNA 1 μL，RNase-free 水加至20 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95℃变性15 s、60 ℃退火与延伸60 s共40个循环。以β-actin为内参。引物由上海生工生物工程有限公司设计合成，Caspase-1 上游引 物5'-CTGAGGGCAAAGAGGAAGCA-3'，下 游 引物3'-CATGATCGCACAGGTCTCGT-5'；GSDMD 上游引物5'-CCAGCATGGAAGCCTTAGAG-3'，下游引物3'-CAGAGTCGAGCACCAGACAC-5'；NLRP3 上游引物5'-TCTGTTCATTGGCTGCGGAT-3'，下游引物3'-TAGCCGCAAAGAACTCCTGG-5'；大 鼠 GAPDH 上游引物5'-CAGGGCTGCCTTCTCTTGTG-3'，下游引物3'-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-5'。

1.5 左室心肌组织中Caspase-1、GSDMD、NLRP3蛋白表达检测 采用Western blotting 法。取左室心肌组织加入液氮研磨，RIPA 裂解液提取总蛋白，用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移到PVDF膜上。使用含5%脱脂奶粉的封闭液，封闭转印膜1 h，与抗pro Caspase-1+p10+p12 抗体（1∶800）、GSDMDC1 抗 体（1∶500）、抗NLRP3 抗 体（1∶800）、β-actin（1∶1 000）4 ℃冰箱中共孵育过夜。次日TBST 洗膜，以HRP 标记的二抗（1∶5 000）室温孵育1 h。TBST 洗膜，将显色液A 液和B 液混合，加2 mL至膜上，用ChemiScope 3000 mini 化学发光仪检测、拍照。Image Lab 软件分析条带灰度值。目的蛋白相对表达量为目的蛋白灰度值/内参灰度值。

1.6 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组心肌细胞超微结构变化比较 对照组心肌细胞膜完整、结构正常；OSAHS组心肌细胞膜完整性被破坏，表现为细胞膜表面欠光滑，形成裂隙、凹陷和大小不等的凸起，细胞膜表面有纤维组织附着，能够看到明显的泡状突起和焦亡小体流出。见图1。

图1 两组扫描电子显微镜下心肌细胞超微结构变化

2.2 两组左室心肌组织中Caspase-1、GSDMD、NLRP3 mRNA 表达比较 与对照组比较，OSAHS 组Caspase-1、NLRP3 mRNA 相对表达量高（P均＜0.05），两组GDMDS mRNA 相对表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组左室心肌组织中Caspase-1、GSDMD、NLRP3 mRNA表达比较（±s）

表1 两组左室心肌组织中Caspase-1、GSDMD、NLRP3 mRNA表达比较（±s）

组别对照组OSAHS组P n 8 8 Caspase-1 mRNA 1.051 ± 0.331 1.516 ± 0.377＜0.05 GSDMD mRNA 1.028 ± 0.261 1.193 ± 0.344＞0.05 NLRP3 mRNA 1.046 ± 0.318 1.506 ± 0.335＜0.05

2.3 两组左室心肌组织中Caspase-1、GSDMD、NLRP3 蛋白表达比较 与对照组比较，OSAHS 组Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、NLRP3 蛋白相对表达量高（P均＜0.05），见表2。

表2 两组左室心肌组织中Caspase-1、GSDMD、NLRP3蛋白表达比较（±s）

表2 两组左室心肌组织中Caspase-1、GSDMD、NLRP3蛋白表达比较（±s）

组别对照组OSAHS组P n 8 8 Caspase-1蛋白0.331 ± 0.039 0.519 ± 0.043＜0.05 GSDMD蛋白0.571 ± 0.015 0.792 ± 0.042＜0.05 GSDMD-N蛋白0.251 ± 0.005 0.370 ± 0.023＜0.05 NLRP3蛋白0.399 ± 0.079 0.645 ± 0.030＜0.05

3 讨论

OSAHS 病因及发病机制复杂，且极易诱发合并症，而在众多由OSAHS 引起的合并症中，心血管疾病是导致严重不良事件的重要原因［8］。OSAHS介导炎症级联反应的诱导和活化，而炎症级联反应又可以促进OSAHS 的发生发展，加剧心脏血管损伤，最终引发心血管系统并发症［9-10］。细胞焦亡是一种新的细胞死亡方式，其特征是形成膜孔，细胞溶解，释放促炎细胞因子和细胞内容物。本研究中，OSAHS组左心室发生心肌细胞细胞膜完整性被破坏，能够看到明显的泡状突起和焦亡小体，提示CIH可诱导心肌细胞发生焦亡。细胞焦亡是一种新型Caspase-1依赖的程序性细胞死亡。Caspase-1 最初被认为是IL-1β 转换酶，将IL-1β 和IL-18 的非活性前体加工成成熟的炎症细胞因子。Caspase-1 的激活不仅可以使炎症细胞因子活化，而且还可通过细胞膜破裂及促炎物质的释放致细胞快速死亡［6］。本研究发现，间歇性低氧大鼠左室心肌Caspase-1 表达上调，提示CIH 激活Caspase-1，使细胞膜破裂，促进细胞膜促炎物质释放。

GSDMD 是焦亡的下游效应物，由1 个功能性的N 端结构域和1 个自抑制的C 端结构域组成。在细胞焦亡过程中，GSDMD 被裂解成GSDMD-N 在细胞质膜上形成孔隙，细胞膜的物理完整性丧失，最终导致细胞肿胀和细胞膜裂解［11］。本研究发现，间歇性低氧大鼠左室心肌GSDMD 和GSDMD-N 的表达上调，亦从蛋白水平证实CIH 促进OSAHS 大鼠心肌细胞焦亡的发生。此结果提示CIH 激活的Caspase-1裂解了GSDMD，诱导心肌细胞焦亡。

细胞焦亡与细胞凋亡和自噬不同，是由炎症小体诱导的细胞死亡的一种炎症形式。NLRP3 是最典型的炎症小体，可介导细胞焦亡的过程［12］。其中经典焦亡通路中NLRP3 炎症小体组成的复合物可以活化下游的Caspase-1 和GSDMD，诱导细胞焦亡，从而促进炎症因子的成熟和分泌［13］。本研究显示，OSAHS 组Caspase-1、GSDMD、NLRP3 表达上调。提示OSAHS 大鼠NLPR3 小体活化，并通过激活Caspase-1 裂解GSDMD 参与了间歇缺氧诱导的心肌细胞焦亡。NLRP3 在心肌炎症相关的心血管疾病（冠状动脉粥样硬化、心肌缺血/再灌注、心肌病、心律失常等）中也发挥着关键的作用［14］。如在心肌梗死动物模型中，抑制NLRP3 炎症小体或凋亡相关斑点样蛋白可减少梗死面积，改善心功能［15-16］。高糖可促进NLRP3 炎症小体介导的细胞焦亡，并通过引起线粒体功能障碍而加重心肌再灌注损伤，而NLRP3 炎症小体抑制剂可减少氧自由基产生并显著减少心肌再灌注损伤［17］。本研究显示，CIH 增加了心肌组织中NLRP3 表达，提示CIH 诱导的焦亡可能与心肌炎症有关。

综上所述，CIH 可诱导心肌细胞焦亡。本研究不足之处在于未进行NLRP3 基因阻断，这是以后研究的方向。