结直肠癌组织中miR-876-5p、PAX6 mRNA表达变化及意义

徐杰，张树朋，李照晋，邵建平

天津市第五中心医院普外科，天津 300450

据全球癌症统计数据显示，2020 年我国结直肠癌新发病例为55.5 万例，死亡病例28.6 万例［1］；预计2022年新发病例和死亡病例分别为59.2、30.9万例［2］。尽管近年来结直肠癌的诊治取得了一定进展，但患者预后仍然较差，因此还需进一步探索结直肠癌发病的分子机制。研究表明，非编码RNA 参与结直肠癌进展［3］。微小RNA（miRNA）是一种小分子非编码RNA，miRNA-876-5p 是miRNA 家族的一个新成员。miR-876-5p 参与髓母细胞瘤、肝癌等恶性肿瘤的发生、发展［4-5］。配对框基因6（PAX6）是一种多功能转录因子，能通过调节下游靶基因转录参与多种恶性肿瘤细胞增殖、分化、侵袭、凋亡［6-7］。本研究通过TargetScan 数据库预测发现，miR-876-5p 与PAX6 存在结合位点，但关于结直肠癌组织中miR-876-5p、PAX6 表达变化及意义尚缺乏报道。基于此，本研究做了相关探讨，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年1月—2019年10月本院收治的86例结直肠癌患者，均经术后病理学检查确诊。其中男51 例，女35 例；≥60 岁41 例、＜60 岁45例；肿瘤部位：直肠55 例、结肠31 例；肿瘤最大径≥5 cm 24 例、＜5 cm 62 例；分化程度：低分化35 例、中高分化51 例；TNM 分期［8］：Ⅰ期17 例Ⅱ期、21 例、Ⅲ期48 例；有淋巴结转移35 例、无淋巴结转移31 例。纳入标准：初诊且入院前未接受任何抗肿瘤治疗；TNM 分期Ⅰ～Ⅲ期；接受姑息性或根治性手术；患者或家属签署知情同意书。排除标准：合并克罗恩病、溃疡结肠炎等其他肠道疾病；合并全身性感染性疾病、自身免疫性疾病、其他部位恶性肿瘤；年龄＜18 岁；临床资料不完整或不能接受随访；院内死亡。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 miR-876-5p 与PAX6 的关系预测 用TargetScan 数据库（https：//www. targetscan. org/）预测miR-876-5p与PAX6的关系。

1.3 结直肠癌组织和癌旁组织中miR-876-5p、PAX6 mRNA 表达检测 采用RT-qPCR 法。术中留取部分癌组织和癌旁组织（距肿瘤边缘＞2 cm）用液氮冷冻后研磨成粉末，TRIzol法提取组织总RNA，微量分光光度计验证纯度、浓度合格后使用Takara 反转录试剂盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）合成cDNA。参考SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒（广州威佳科技有限公司）说明书进行扩增，引物设计和合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。miR-876-5p 引物：上游 5′-ACACTCCAGCTGGGTTTGTGACCTGGTCCA-3′，下游5′-TGGTGTCGTGGAGTCGTGTCGTGGAGTC-3′；内参U6引物：上游5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；PAX6 引物：上游5′-TCTTTGCTTGGGAAATCCG-3′，下游5′-CTGCCCGTTCAACATCCTTAG-3′；内参GAPDH 引物：上游5′-GGCACTGAGAAGCGGGGCCG-3′，下游5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。 反应条件：95 ℃ 90 s；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，循环40次。用2-ΔΔCT法计算miR-876-5p、PAX6 mRNA 相对表达量。

1.4 预后分析 患者出院后通过门诊或电话随访3年，随访至2022年10月或患者死亡，计算3年累积生存率。根据结直肠癌组织中miR-876-5p、PAX6 mRNA表达水平将患者分为miR-876-5p高表达组（≥0.59，n=42）、miR-876-5p 低表达组（＜0.59，n=44），PAX6 mRNA 高表达组（≥0.98，n=47）、PAX6 mRNA低表达组（＜0.98，n=39）。

1.5 统计学方法 采用SPSS28.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验；结直肠癌组织中miR-876-5p 与PAX6 mRNA 表达的相关分析用Pearson 相关法；绘制结直肠癌患者生存曲线，组间生存率比较用Log-rank 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织与癌旁组织中miR-876-5p、PAX6 mRNA表达比较 结直肠癌组织中miR-876-5p相对表达量低于癌旁组织，PAX6 mRNA相对表达量高于癌旁组织（P均＜0.05）。见表1。

表1 结直肠癌组织与癌旁组织中miR-876-5p、PAX6 mRNA表达比较（±s）

表1 结直肠癌组织与癌旁组织中miR-876-5p、PAX6 mRNA表达比较（±s）

组织癌组织癌旁组织P n 86 86 miR-876-5p 0.59 ± 0.11 0.98 ± 0.17＜0.05 PAX6 mRNA 0.98 ± 0.15 0.52 ± 0.08＜0.05

2.2 结直肠癌组织中miR-876-5p 与PAX6 mRNA表达的相关性 经在线网站https：//www. targetscan. org/预测，miR-876-5p 与PAX6 的3'-非翻译区691-697 存在结合位点。Pearson 相关分析显示，结直肠癌组织中miR-876-5p 表达与PAX6 mRNA 表达呈负相关（r=-0.754，P＜0.05）。

2.3 结直肠癌组织中miR-876-5p、PAX6 mRNA 表达与临床病理参数的关系 结直肠癌组织中miR-876-5p、PAX6 mRNA 表达与肿瘤分化程度、TNM 分期、淋巴结转移有关（P均＜0.05），与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤最大径无关（P均＞0.05）。见表2。

表2 结直肠癌组织中miR-876-5p、PAX6 mRNA表达与患者临床病理参数的关系（±s）

表2 结直肠癌组织中miR-876-5p、PAX6 mRNA表达与患者临床病理参数的关系（±s）

临床病理参数性别 男 女年龄 ≥60岁 ＜60岁肿瘤部位 直肠 结肠肿瘤最大径 ≥5 cm ＜5 cm分化程度 低分化 中高分化TNM分期 Ⅰ～Ⅱ期 Ⅲ期淋巴结转移 有 无n 51 35 41 45 55 31 24 62 35 51 38 48 35 51 miR-876-5pimages/BZ_13_674_338_698_384.png±s 0.58 ± 0.11 0.60 ± 0.10 0.57 ± 0.11 0.60 ± 0.10 0.58 ± 0.11 0.61 ± 0.10 0.55 ± 0.10 0.60 ± 0.11 0.56 ± 0.10 0.61 ± 0.10 0.62 ± 0.11 0.56 ± 0.10 0.55 ± 0.09 0.62 ± 0.10 P＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＜0.05＜0.05 PAX6 mRNAimages/BZ_13_674_338_698_384.png±s 0.98 ± 0.15 0.97 ± 0.15 0.99 ± 0.13 0.97 ± 0.16 1.00 ± 0.14 0.95 ± 0.15 1.02 ± 0.12 0.96 ± 0.15 1.02 ± 0.14 0.95 ± 0.15 0.93 ± 0.14 1.01 ± 0.14 1.03 ± 0.14 0.94 ± 0.14 P＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＜0.05＜0.05

2.4 结直肠癌组织中miR-876-5p、PAX6 mRNA 表达与预后的关系 86例结直肠癌患者随访6～36个月，失访6 例，死亡18 例，3 年累积生存率为79.07%（68/86）。miR-876-5p 高表达组3 年累积生存率90.48%（38/42）高 于miR-876-5p 低 表 达 组 的68.18%（30/44）；PAX6 mRNA 高表达组3 年累积生存率70.21%（33/47）低于PAX6 mRNA 低表达组的89.74%（36/39），比较差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

3 讨论

研究表明，表观遗传学在结直肠癌中扮演重要角色［9］。miRNA 是表观遗传学的一个新的研究热点，能通过与mRNA 的3'-非翻译区互补或配对引发mRNA 降解或转录后沉默，进而调控结直肠癌发生发展［10-11］。miR-876-5p 定位于人9 号染色体短臂21.1 处，最初研究发现miR-876-5p 能通过Toll 样受体4/核因子-κB 信号通路参与炎症级联反应；近年研究发现miR-876-5p 定还参与肿瘤过程，如miR-876-5p 能靶向G 蛋白亚基γ12 激活磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶B 信号通路抑制胶质瘤细胞增殖、迁移［12］；同时能靶向G 蛋白偶联受体激酶5 抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移［13］。本研究结果显示，结直肠癌组织中miR-876-5p 表达降低，其机制可能是miR-876-5p 启动子被甲基化导致表达沉默有关［12-13］。本研究结果还显示，结直肠癌组织中miR-876-5p 表达与分化程度、TNM 分期、淋巴结转移有关，进一步说明miR-876-5p 低表达参与结直肠癌发生发展，其机制可能与miR-876-5p 能靶向RAS 蛋白激活样因子2（RASAL2）有关。RASAL2 是一种RAS-GTP 酶激活蛋白，能通过诱导结直肠癌上皮-间充质转化促进其发生发展［14］。REN 等［15］实验显示，miR-876-5p 能靶向RASAL2 抑制结直肠癌细胞增殖和侵袭。

结直肠癌是多因素参与的复杂过程，其过程中伴随多个基因的异常表达［16-17］。PAX6 是一种核转录因子，具备同源结构域和配对结构域两个DNA 结合域，能通过识别和结合特点的DNA 序列盒，激活或抑制钙黏蛋白、B 细胞淋巴瘤/白血病-2、细胞周期蛋白D1、p21、p27等下游靶基因调控细胞增殖、分化、侵袭、迁移和凋亡［18］。基于PAX6 对多种基因的调控作用，有大量研究报道了其与肿瘤的关系，如PAX6 能靶向抑制同源域转录因子1 增强胃癌细胞增殖和侵袭能力［19］；能靶向上调N-钙黏蛋白、波形蛋白促进视网膜母细胞瘤增殖和侵袭［20］。本研究结果显示，结直肠癌组织中PAX6 mRNA 表达降低，其机制可能与PAX6 的启动子被结直肠癌中原癌基因激活转录而大量表达有关［19-20］。本研究结果还显示，结直肠癌组织中PAX6 mRNA 表达与分化程度、TNM 分期、淋巴结转移有关，进一步说明PAX6 mRNA 高表达参与结直肠癌发生发展，其机制可能与激活或抑制下游靶基因有关。如PAX6能上调N-钙黏蛋白表达和抑制E-钙黏蛋白表达，增强结直肠癌细胞活力，促进其增殖和转移［21］。通过TargetScan数据库预测发现，miR-876-5p 与PAX6 存在结合位点，相关性分析也发现结直肠癌组织中miR-876-5p与PAX6 mRNA 表达呈负相关，提示二者可能共同参与结直肠癌的发生、发展。李程等［22］研究也报道，上调miR-876-5p 表达能靶向下调PAX6 表达，抑制结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和促进其凋亡。进一步验证了本研究结果。为探究miR-876-5p、PAX6 与结直肠癌患者预后的关系，本研究通过随访发现，miR-876-5p 高表达和PAX6 mRNA 低表达的结直肠癌患者3 年累积生存率更高，提示miR-876-5p、PAX6 mRNA表达还与结直肠癌患者预后有关，有望成为结肠癌患者预后潜在指标。

综上所述，结直肠癌组织中miR-876-5p 高表达和PAX6 mRNA 低表达与病理参数和预后相关，二者可能共同参与结直肠癌进展。但本研究样本量较少且为临床研究，还需进一步大样本研究证实，并深入研究miR-876-5p、PAX6参与结直肠癌发生发展的机制。