施用海藻肥和大豆海藻肥对烤烟生长与土壤微生物的影响

张 鑫，胡希好，胡志明，刘 浩，王越茂，赵福彬，程昌新，李贵忠，褚德朋，尹绍静，程亚东，尤祥伟，李义强

[1.中国农业科学院烟草研究所，山东青岛 266101；2.山东青岛烟草有限公司，山东青岛 266101；3.云南省烟草公司保山市公司，云南保山 6780992；4.红云红河烟草(集团)有限责任公司，云南昆明 650202；5.中国烟草云南进出口有限公司，云南昆明 650031]

多年来，由于施肥模式、种植制度及栽培方式等不尽合理，导致我国烟叶质量整体下降[1]。发展有机肥料，因地制宜开发和施用有机肥，促进烟叶产量质量的提高是目前被普遍采纳的有机农业生产模式[2]。长期施用有机肥可以调节土壤微生态、提高土壤微生物整体代谢活性、增加土壤微生物多样性和功能多样性，进而提高土壤的生态功能，对促进烟株生长产生积极的影响[3-5]。

海藻有机肥作为一种天然的绿色有机肥料，含有大量的营养元素和氨基酸、多糖、甜菜碱、植物生长素等多种活性物质，不仅能提供植物生长发育的必需营养，还可提供植物生长调节剂，并且与普通化学肥料相比，海藻肥拥有安全无毒等优势[6-8]。杨锦等研究发现，海藻有机肥的施用能够显著促进根系生长，提高土壤酶活性、土壤微生物活性和作物抗逆性，从而有效提高作物产量和品质[9-10]。利用海藻有机肥是绿色农业生产需要，在烟草上亟需推广，但目前缺乏相关研究，而且由于我国缺乏完善的肥料效果评价体系，目前市面所售应用于烟草的有机肥质量参差不齐，肥料效果差别很大，因此开发筛选优质高效海藻有机肥对促进烟草生长发育具有重要意义。

本试验以烤烟品种中烟100为材料，通过田间小区试验，研究不同施用量的海藻肥和大豆海藻肥对烟株生长发育的影响，从土壤养分有效性以及土壤微生物群落结构的角度，探索不同有机肥在促进烟株生长发育方面的作用。对开发绿色高效的烟草海藻有机肥，实现烟草行业绿色防控、肥料减量、烟田土壤绿色高效保育模式的现实需求具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验地点与材料

试验于2019年4月在山东省青岛市黄岛区六旺镇(35°57′16″N，119°44′18″E)进行。该地土壤类型为棕壤，pH值4.18，有机质含量15.94 g/kg，铵态氮含量0.018 7 g/kg，硝态氮含量0.030 9 g/kg，速效钾含量276.60 mg/kg，速效磷含量28.88 mg/kg。供试品种为当地主栽烤烟品种中烟100。试验所用烟草专用肥(N含量≥10%，K2O含量≥20%，P2O5含量≥10%)450 kg/hm2、硫酸钾含量225 kg/hm2统一按照当地烟草公司标准执行。市售普通有机肥含量(N+P2O5+K2O≥6%，有机质含量≥45%；主要原料为有机质、有机钙、有益菌)于当地农资公司购买；海藻肥为青岛海大生物集团有限公司提供的海状元有机肥(N+P2O5+K2O含量≥6%，有机质含量≥45%；主要原料为有机质、海洋生物钙粉、海洋有益菌、海藻提取物)；大豆海藻肥为青岛农特生物科技有限责任公司提供的烟大帅有机肥(N+P2O5+K2O含量≥5%，有机质含量≥65%；主要原料为有机质、发酵大豆和海藻废弃物、海洋有益菌)。

1.2 试验设计

海藻肥(SF)、大豆海藻肥(SSF)分别与烟草专用肥混合，条施后起垄，垄高30 cm，垄体饱满。试验采用单因素随机区组设计，共设置8个处理(表1)，每个处理重复3次，每个小区种植50株，行距120 cm，株距50 cm，四周设保护行。于2019年4月移栽大田试验烟苗。试验过程中严格按照当地优质烟生产技术规范执行。

表1 试验处理

1.3 测定项目及方法

1.3.1 农艺性状调查 于团棵期每个小区选取 3 株代表性烟株，沿茎基部切开，洗净并擦干表面水分后立即测量烟株地下部分和地上部分鲜质量[11]，随后置于烘箱105 ℃杀青30 min，65 ℃烘干至恒质量；于旺长期每个小区选取 5 株代表性烟株，根据YC/T 142—2010《烟草农艺性状调查测量方法》标准测定农艺性状。

1.3.2 土壤样品采集及测定 于移栽后60 d采用5点取样法采集450 kg/hm2用量海藻肥和大豆海藻肥处理土样，采用抖根法采集450 kg/hm2用量海藻肥和大豆海藻肥处理根际土和非根际土，采集后混合均匀[12]。将采集后的土样分别等量混合后分为2个部分，其中一部分置于-80 ℃超低温冰箱中用于土壤微生物的测定，另一部分自然风干后过 0.25 mm 筛，测定土壤样品的理化性质[13].。

1.3.3 烟叶样品采集及测定 根据王新月等的方法[14]，检测杀青样烟叶元素含量。于移栽后60 d(旺长期)，每小区选取 5 株代表性烟株，采集相同部位2张烟叶，于105 ℃烘箱杀青30 min后于 65 ℃ 烘干至恒质量，用粉碎机粉碎后过20目筛，用于烟叶元素含量的测定。

1.3.4 高通量测序分析微生物群落 采用 DNeasy® PowerSoil® Kit(100)试剂盒提取DNA，随后进行PCR扩增产物检测[12]。由北京诺禾致源科技股份有限公司构建高通量测序文库和完成基于Illumina MiSeq平台的测序[13]。

1.4 数据处理与统计分析

运用FLASH软件对Reads进行拼接。使用Uparse软件在相似性为97%的水平下对优质序列进行OTU聚类。对比silva 数据库(细菌)以对OTU序列进行物种注释及丰度分析。采用 Microsoft Excel 2019 软件对数据进行处理和绘图，采用SPSS 26.0 统计分析软件对数据进行差异显著性检验(Duncan’s 新复极差法，α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同有机肥处理对烟株生长的影响

不同用量SF和SSF的施用对烟株团棵期地上部分和地下部分的鲜质量均产生了影响(表2)。SF300处理团棵期地下部鲜质量和地上部鲜质量较CK均大幅度提高，但与CK0无显著差异；SF450处理团棵期地上部鲜质量和SF600处理团棵期地下部鲜质量分别较CK大幅度提高；SSF300、SSF600处理团棵期地下部鲜质量均与CK差异显著，较CK分别提高101.35%、83.86%。结果表明，施用2种有机肥可不同程度地影响团棵期烤烟地下部、地上部鲜质量。

2种海藻有机肥对烟株的生长发育均具有较好的促进作用，但各农艺性状指标对不同添加量的2种海藻有机肥的响应各异(表3)。与CK相比，SF各处理均可影响烟株的农艺性状，其中SF450处理促进效果最佳。SF450处理与CK相比，农艺性状各项指标均有较大提高。SSF的施用对烟株长势整体改善更为可观，其中SSF450、SSF600处理提升效果最为显著，各项指标较CK均大幅度提高。表明中用量海藻肥、中用量和高用量大豆海藻肥促进烟株生长的效果较好。

2.2 不同有机肥处理对土壤化学性质的影响

2种有机肥施入烟田后，烟田的土壤化学性质见表4。根际土壤中各处理pH值和土壤速效磷含量较CK和CK0均无显著差异；土壤速效钾含量SF450、SSF450处理较CK显著提高；而SSF450处理的土壤铵态氮含量较CK0提高64.86%，土壤硝态氮含量较CK、CK0分别提高156.76%、280.00%。非根际土壤中各处理pH值较N-CK、N-CK0无显著差异；N-SSF450处理与N-CK相比，土壤速效磷含量、土壤速效钾含量、土壤铵态氮含量、土壤硝态氮含量均显著提高；而N-SF450处理与N-CK和N-CK0相比无显著提高趋势。SF、SSF的施用有效改善了土壤养分。

表4 不同有机肥处理旺长期土壤化学性状比较

2.3 不同有机肥处理对烟叶元素含量的影响

旺长期阶段，施用不同用量的2种有机肥能在不同程度上影响烟叶元素含量(表5)。与CK相比，SF300、SSF300处理烟叶全氮含量均无显著差异，但烟叶全钾含量显著降低；而SF450、SF600、SSF450、SSF600处理烟叶全氮含量均显著降低，但烟叶全钾含量均无显著差异；各处理烟叶全磷含量与CK均无显著差异。

表5 不同有机肥处理旺长期烟叶元素含量比较

2.4 不同处理对微生物多样性和结构的影响

本研究采用基于Bray-Curtis距离的主成分分析(PCA)比较了不同肥料处理条件下根际土壤(图1-a)和非根际土壤(图1-b)的细菌群落变化情况。从图1-a中可以看出SSF450处理形成了远离其他处理的明显聚类，表明SSF的施用较大程度地改变了烟株根际土壤的细菌群落结构，而SF450处理和CK0对烟株根际土壤的细菌群落结构影响较小。图1-b是非根际土壤细菌属水平上的PCA，SF450和SSF450处理均与CK和CK0差异明显，且SSF450处理差异最大；说明2种有机肥的施用均改变了烟株非根际土壤的细菌群落结构，且SSF450处理对烟株根际和非根际土壤细菌群落结构的影响更大。

不同试验处理根际与非根际土壤微生物属水平群落组成及相对丰度前10位物种如图2所示。从图2可以看出，根际土壤和非根际土壤中不同细菌属数量，其中Acidibacter、Bryobacter以及Sphingomonas属于根际土壤和非根际土壤的优势菌群。与CK相比，SF组中Acidibacter、Sphingomonas相对丰度升高，而在SSF450组中这3菌群相对丰度均升高；而与CK0相比，在SF450组中Sphingomonas相对丰度升高，在SSF450组中Bryobacter、Sphingomonas相对丰度升高；非根际土壤中，同NCK和NCK0相比较，Acidibacter、Sphingomonas在NSF450组和NSSF450组中相对丰度均显著升高。

各处理组之间根际土壤和非根际土壤组间差异物种见图3。根际土壤中SF450处理均与CK和CK0在Nocardioides中差异显著，且SF450处理在该属中的相对丰度均高于CK和CK0，而SSF450处理在Bryobacter中显著高于SF450处理，在Nocardioides中与之相反；非根际土壤中NSF450、NSSF450处理在Gemmatimonas中均显著高于NCK和NCK0，且NSF450处理在Nocardioides、Mizugakiiibacter中显著高于NCK，在Bradyrhizobium、Chthonomonas中显著高于NCK0，NSF450与NSSF450处理在Conexibacter、Nocardioides中差异显著，且NSF450在3属中的相对丰度均显著高于NSSF450处理。

3 讨论与结论

施用有机肥既可以为烟叶生产提供所需营养，提高烟叶产量和改善烟叶品质，还可以显著改善土壤理化性质，同时使土壤肥力得到提高[15]。研究结果表明，2种海藻有机肥的施用明显改善了烟株的生长状况，团棵期地下部鲜质量和地上部鲜质量较CK相比均提高，且有机肥的施用使旺长期烟株农艺性状与CK相比均大幅度增加。这与张蕊等的研究结果[15]一致，施用海藻有机肥可以通过多种机制的协同效应，大大改善土壤质量，诱导根系产生多胺和植物激素类物质，促进烟草根系和植株的生长发育。本试验结果显示，与CK相比，海藻肥和大豆海藻肥的施用对土壤养分含量进行了有效改善，尤其是大豆海藻肥的施用使土壤速效钾、硝态氮等含量得到较大提高。何浩等发现，商品有机肥的施用使土壤有机质含量、速效磷含量、碱解氮含量均有显著提高，说明施用有机肥能改善土壤理化特性和养分供应[16-17]。氮、磷、钾元素直接参与植物的新陈代谢，与植物的生长关系密切[5]。本研究结果显示，施用中、高用量海藻肥和大豆海藻肥后，烟叶全氮含量较CK显著降低，但烟叶全钾、全磷含量与CK无显著差异，可能原因为此阶段烤烟由氮代谢转入碳代谢[18]，有关有机肥对烟叶养分吸收影响的机制还需要进一步研究阐明。

土壤微生物的群落组成及多样性是反映土壤微生物群落生态功能的重要指标[4]。海藻肥和大豆海藻肥施用后根际土壤和非根际土壤在属水平上的群落组成及相对丰度分别表现出不同的变化。这与张明宇等的研究结果[19]一致，有机肥的施入可以影响土壤微生物区系结构，还对微生物的群落多样性有所调节。Chen等发现，海藻有机肥的施入使土壤优势菌群的相对丰度产生了有规律的变化，对土壤微生物的多样性也有影响[20]。分析有机肥施用后根际土壤和非根际土壤在属水平上的群落组成及相对丰度，Acidibacter、Sphingomonas和Bryobacter均属于根际土壤和非根际土壤的优势菌群。Acidibacter和Bryobacter为酸杆菌门，Pramanik等研究发现，酸杆菌门可以调节土壤pH值和参与腐殖质分解的碳循环过程，还能促进土壤硝化反应，增加土壤中可溶性氮的含量[21]。2种有机肥处理的根际土壤和非根际土壤优势菌群Sphingomonas丰度较CK和CK0均增大。Krishna等研究发现，Sphingomonas属于氨氧化细菌，与土壤硝化作用、土壤氮循环及生物固氮作用关系密切[22]。Yan等发现，Sphingomonas可以促进根系生长，并在提升烟叶品质方面发挥重要作用[23]。2种有机肥处理的根际土壤和非根际土壤中非优势菌群Massilia丰度与CK相比均有不同程度的增大。相关研究表明，Massilia具有溶磷作用，能有效改善土壤养分[24]，在防治土传病害方面也具有重要作用[25]。分析各处理组之间根际土壤和非根际土壤组间的差异物种，有机肥的施用增加了土壤中有益菌群的相对丰度。相关研究表明，Nocardioides、Gemmatimonas对改善土壤环境起着积极作用[26-27]。Conexibacter和Bradyrhizobium具有生物固氮作用，可有效改善土壤养分[28-29]。Mizugakiiibacter和Chthonomonas与防治作物土传病害关系密切[30-31]。

海藻肥和大豆海藻肥的施用可有效改善土壤理化性状及养分，影响土壤微生物群落结构及多样性，增加土壤中Sphingomonas、Acidibacter等有益细菌的相对丰度，从而促进了烟株在团棵期、旺长期的生长发育。综合分析，中、高用量的海藻肥和大豆海藻肥的施用效果较佳，可满足烟草生产的实际需求。