高粱类缺钾症状种质矿质元素含量分析及基因定位

朱振兴，曲匡正，李 丹，王春语，白春明，陆晓春

(辽宁省作物分子改良重点实验室/辽宁省农业科学院高粱研究所，沈阳辽宁 110161)

高粱是全球五大作物之一，在我国也是重要的杂粮作物[1]。高粱具有耐瘠薄、耐旱、耐盐等特性，一般种植于边际土地上，对利用瘠薄、干旱、盐碱的土地有重要影响[2]。另一方面，高粱在我国白酒酿造、国民膳食结构调整及扶贫工作中占有重要地位[3]。钾是植物三大重要元素之一，是植物细胞中主要的无机离子，在干质量中最高能占10%[4]。钾离子在植物体内作用广泛，对植物的生长、发育、代谢、抗性等方面都有重要影响。钾离子参与一些酶的激活、维持蛋白的合成、细胞质内的pH值的动态平衡等过程[5]。还参与韧皮部运输有机溶液，如参与蔗糖从地上运输到根部的过程中，或是运输到果实等一些“库”组织的过程中起重要的作用[6]。在调节细胞膨压、调控渗透压的变化、维持细胞电荷平衡，影响细胞的生长，影响细胞对环境的反应，如气孔运动、向光性、向地性和细胞伸长等[7]。

根系是植物吸收钾的主要组织器官，从根系表皮和皮层细胞吸收钾，然后运输到中柱，通过中柱将钾养分输送到需要的组织和器官[8]。由于脂质双层细胞膜是不可渗透离子，所以钾必须通过膜上的特异转运蛋白才能进入根中[9]。现在一般认为高亲和性钾吸收系统主要是由质膜上的钾转运体参与，如HAK5钾离子转运体[10]，可能也有离子通道参与；而低亲和性钾吸收系统主要是质膜上的钾离子通道，如离子通道蛋白AKT1[11]，一般被认为是被动运输过程，不需要消耗ATP。位于膜上的钾离子通道可能构成了低亲和性钾吸收系统[12]。另一方面，钾吸收系统也受转录水平及转录后水平调控。钾离子的吸收利用分子机制在水稻中和拟南芥中有相对深入的研究，但在高粱中基本不清楚[13]。钾肥相对价格较贵，当季利用率约为50%[14]，其余的钾肥被浪费并排放到环境中，不经济也不环保。作物缺钾时，叶片上一般可见发黄、褐色斑点，叶尖、叶缘呈现褐色小斑点，然后逐步褐变枯死，而且老叶比新叶症状更严重，最终严重影响产量。因此通过鉴定类缺钾突变体或种质，发掘与钾吸收利用相关的基因，对培育钾养分高效高粱有重要作用。

一般钾吸收利用分子途径知识来自突变体研究较多，而自然种质的报道较少。从国际半干旱作物研究所引进的高粱核心种质资源中[15]，有1份高粱种质编号8-10在拔节后，叶尖及叶片边缘逐渐出现紫褐色斑点，然后逐步坏死，类似于缺钾症状。而正常生长的高粱叶片在籽粒成熟之前一般并不会产生紫褐色坏死斑点。从2012—2015年连续3年的田间正常种植条件下，表型观察高粱种质 8-10 叶片的表现稳定、一致，因此确定这是一份特异的类缺钾症状种质资源。本研究对高粱类缺钾症状种质8-10进行表型和不同位置叶片进行矿质含量的分析，组配F2群体，研究该性状的遗传特性，并通过BSA-Seq高通量测序对该性状控制基因进行粗定位。

1 材料与方法

1.1 材料与田间种植条件

高粱微核心种质材料8-10，以参考基因组测序品种BTX623作为参照品种。田间种植条件，为一般高粱田间种植条件，正常进行浇水、施肥、病虫害管理等。种植行距为40 cm，株距为20 cm，行长为 2 m。

1.2 矿质含量测定

在开花时期，取BTX623以及8-10不同位置的新鲜叶片，每个位置叶片取2株长势基本一致植株同位置的叶片混在一起，计为1个样品，3个生物学重复，即将6株苗的叶片进行烘干至恒质量。烘干过程如下，新鲜叶片首先120 ℃杀青30 min，然后80 ℃烘至恒质量，一般4 d即可。在进行矿质含量分析时需要注意的是，要用陶瓷剪刀将样品进行剪碎(避免铁元素或其他金属元素污染)。取碎的混匀干样叶片约0.1 g，加入6 mL浓硝酸和2 mL浓H2O2(浓度一般为30%)，过夜预硝化，然后用微波硝煮仪(美国CEM公司MARS6)按照说明书进行消化至澄清液体，冷却后开盖，其后对消化管进行赶酸至体积约0.5 mL，最终定容至25 mL，采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)(美国珀金埃尔默公司Optima 8000)进行矿质元素含量的测定。

1.3 基因组DNA提取以及BSA-Seq高通量测序分析

首先进行定位群体的构建，将叶片颜色正常品种BTX623与8-10类缺钾症状种质进行杂交获得F1，然后套袋自交得到F2。将F2群体植株种植于田间，正常施肥管理。在田间F2群体开花后大概2周，采集叶片颜色正常的表型植株50株，典型类缺钾症状叶植株50株，以及父母本2个材料进行基因组DNA提取。由于高通量测序对基因组DNA条带质量要求高，DNA提取采用试剂盒法(天根生物科技有限公司植物基因组DNA提取试剂盒DP320)，所用新鲜叶片大概100 mg，按照说明书进行提取，然后用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，要求条带清晰、无拖尾；用核苷酸紫外分光光度计Nanodrop测定DNA的浓度(美国赛默飞世尔科技公司)以及D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm，确保比值在1.8～2.0之间。BSA-Seq测序时2个DNA混池要求均匀混合每个样品，每个样品浓度要求大于50 ng/μL，总量为100 ng，然后将检验合格的DNA样品送样至北京百迈克生物科技有限公司进行高通量测序分析。

本研究利用北京百迈客生物科技有限公司自主研发的特异性位点扩增片段测序(specific locus amplified fragment sequencing，SLAF-seq)技术[16]对高粱类缺钾症状F2遗传分离群体(2个亲本和50+50的混池)进行关联分析，最终获得与类缺钾性状紧密关联的分子标记和候选区域。SLAF高通量测序分析流程简述如下：首先通过高粱基因组进行方案预测，选择HaeⅢ+RsaⅠ 酶进行酶切，SLAF标签长度选择在364～414 bp 之间，预测到113 111个SLAF标签，SLAF标签在基因组上基本分布均匀，位于重复序列区的SLAF标签比例为8.77%。酶切完后进行建库，基因组DNA片段经过加接头、PCR扩增等，然后进行上机测序，其后进行生物信息学分析。对获得的原始数据进行接头序列等序列的过滤，然后得到clean data，利用BWA软件进行比对到参考基因BTX623上，然后进行单核苷酸多态性(SNP)位点的检测，依据检测出的SNP位点，计算SNP-index差值，主要是寻找混池之间基因型频率的显著差异，用Δ(SNP-index)统计。标记与性状关联度越强，Δ(SNP-index)越接近于1。最终挑出显著差异的区域，定位候选区域。

2 结果与分析

2.1 高粱8-10叶片表型观察

由于该种质来源于国际半干旱作物研究所引进的高粱核心种质资源，在对照方面，选取BTX623参考基因组测序品种作为比较对象。高粱8-10种质在苗期拔节前，叶片上几乎无紫褐色坏死斑点，与其他品种如BTX623并无显著差异。之后叶尖、叶片边缘逐步出现紫褐色坏死斑点，到了开花后叶片中就出现了大量紫褐色坏死斑点；在老叶中越来越多，而且是从叶尖到边缘逐渐坏死。如图1所示，旗叶到第7叶，紫褐色坏死斑点呈现增多的趋势，特别是新叶中少，老叶中多。而一般的高粱种质叶片如参照品种BTX623品种在此时期叶片不论是旗叶还是其他位置叶片叶尖、叶缘都没出现紫褐色坏死斑点。

2.2 高粱8-10不同位置叶片矿质含量分析

由于高粱8-10种质叶片叶尖、叶缘出现紫褐色坏死斑点，类似于缺钾的症状，而且符合老叶症状严重，新叶轻的特性。为验证该紫褐坏死斑点的产生是否与矿质元素含量的影响有关，特别是那些可移动的矿质元素，如镁、钾、钙、磷、钠、铁、锰、铜等。将8-10与BTX623最上面的3片叶片中矿质元素含量(旗叶为L1，往下依次为L2、L3)进行比较可知，钾、镁以及钙元素在3个叶片之间的变化趋势与BTX623有较大的不同，钾含量在8-10倒3叶中较倒2叶降低了25.3%；而镁、钙离子的积累模式与BTX623叶也不同，特别是在倒3叶中较倒2叶中分别增加了72.1%以及57.8%；其他元素如磷、钠、铁等元素在不同叶片中的分布模式与BTX623差异并不明显(图2)。

2.3 遗传分析

将高粱类缺钾种质8-10与BTX623进行杂交获得F1，F1植株叶片表现正常，无褐紫色坏死斑点，表明该性状控制基因属于隐性控制基因。F1自交得到F2群体，播种于田间并进行表型的观察。在植株开花后约10 d，进行褐紫色坏死斑点的统计。将叶片上的褐紫色坏死斑点的数量分为4个等级：1级，叶片无或几乎无褐紫色坏死斑点；2级，叶片中少量褐紫色坏死斑点；3级，中等量褐紫色坏死斑点；4级，褐紫色坏死斑点数量与8-10种质相似。在F2中进行褐紫色坏死斑点性状等级调查，结果表明，叶片表现为无或几乎无褐紫色坏死斑点的植株有349株(W型)，而携带褐紫色坏死斑点的植株3个类型合计为312株(B+、B++以及B+++)。叶片W型植株与叶片携带B型的植株数量进行9∶7分离比例的Pearson卡方测试，结果表明P值大于0.05，符合9∶7分离比例(表1)。该分离比例表明，褐紫色坏死斑点控制基因受2对隐性基因控制。但在有褐紫色坏死斑点斑点的植株中，并不符合2个没有相互作用的隐性基因的遗传规律，表明这2个基因之间很可能是存在互作关系的。

表1 F2群体叶片斑点的遗传分析结果

2.4 BSA-Seq高通量测序分析

在高粱类缺钾种质8-10与BTX623进行杂交获得的F2群体中，挑选极端表型个体各50株，即50株F2植株中叶片表型与8-10一致，50株F2植株叶片表型与BTX623一样，完全无褐紫色坏死斑点以及2个亲本。然后提取基因组DNA，构建DNA混池，建库、测序以及生物信息学分析。对得到的17 847个候选多态性SLAF标签，通过SNP-index方法进行关联分析，拟合后的关联阈值为 0.495 766，共获得868个与性状显著相关的SLAF标记，将该基因关联到第4条染色体上7.61 Mb的区间上(物理位置为 51 504 457～59 110 341 bp)，关联区间内的SLAF标记为179个，该区间内预测有885个基因(图3)。

由于上述分析得到的关联区域较大，因为该褐紫色坏死斑点叶片控制基因为隐性基因，可将根据具有隐性性状表型的混池对得到的关联侯选区域进一步分析，将关联区域细化，进一步缩小目标基因范围。选择SNP-index(aa)>0.9的性状关联标记，进一步细化了关联侯选区域共定位到14个热点区域，热点区域大小约为2.88 Mb，关联到76个分子标记，该区间内预测有317个基因(表2)。

表2 基因关联热点区域汇总

3 讨论

钾元素是作物生长所必需的三大元素之一，在植物生长发育中发挥重要作用。作物在缺钾时，会影响叶绿素合成，严重时最终影响产量[17-18]。钾肥价格相对较高，田间当季利用率不高，培育钾高效作物，提高作物对钾肥的吸收、利用效率，是非常重要的途径[19]，挖掘与钾吸收利用相关的基因有重要的意义。本研究利用高粱核心种质资源中的1份类缺钾症状种质，其叶尖和边缘有较多褐紫色坏死斑点，而且呈现老叶症状重、新叶轻的特点。对不同位置的叶片进行了矿质元素含量的分析，发现2个元素在老叶与新叶中的积累模式与BTX623不同。对该种质叶片类缺钾表型进行了遗传分析和定位，将该基因定位在第4条染色体上7.61 Mb的区间内。

现在钾养分相关分子途径研究结果，一般来自人工诱变突变体或是来自正向遗传学研究，鲜有来源于自然种质研究[20]。本研究中的类缺钾症状种质8-10，从不同位置叶片离子含量测定的结果来看，8-10中倒3叶中钾离子含量最低，较倒2叶降低了25.3%(图2)；而且钾离子在不同位置叶片中的分布与BTX623也不同，在BTX623中这个时期钾离子在前3个叶片中的含量几乎无差异，而在8-10中，前2片叶子钾离子含量也无差异，而倒3叶钾含量明显下降；钙离子和镁元素的含量在8-10中倒3叶中明显增加，而前2片叶子中含量几乎不变。8-10中倒3叶已出现可见的褐紫色坏死斑点，而倒1和倒2叶没有明显的斑点(图1-B)。植物在缺钾条件下，一般会促进其他阳离子的吸收，如钙、镁，从而缓解缺钾的影响[21-22]。本研究中在8-10倒3叶中钾元素含量较倒2叶明显下降，与之对应的是钙和镁含量的大幅度增加。同样为可移动元素的大量元素磷元素在此时期8-10种质中的前3片叶片中几乎无变化，表明植株在这个时期老叶中的可移动元素并未向新叶中转移，叶片中缺钾很可能是8-10种质显示类缺钾症状的直接原因。

从遗传分析上看，该类缺钾表型符合2对隐性基因控制的分离比例，但是并不符合2对无互作的基因分离比例，因而该类缺钾症状控制的2对基因间很可能是存在互作关系的，至于互作的方式需要进一步深入精细定位、克隆基因才能阐述清楚。值得注意的是，我们利用BSA-Seq将该基因定位在第4条染色体上7.61 Mb的区间内，到底控制类缺钾症状的2个基因都在这一区间内，还是一个在第4条染色体上，另一个基因分布在其他染色上暂时无法确定。因为毕竟BSA-Seq高通量测序定位所使用的极端个体，挑选的都是与8-10个叶片表型高度一致的个体，那些表型相对弱的个体暂时并未使用到定位分析中。因此下一步需要精细定位使用不同表型个体将该基因克隆出来。另一方面，由于8-10是来源于自然种质的材料，BTX623只能作为一般参照品种，并不能直接准确进行该类缺钾症状控制基因对其他农艺性状影响的评估，将来需要构建近等基因系材料，从而进行该基因对其他农艺性状影响的精确分析。

4 结论

本研究从国际高粱核心种质资源中发现了1份叶尖褐变逐渐坏死的类缺钾症状种质。表型性状分析发现，该类缺钾症状种质在苗期叶片较其他品种如BTX623并无显著差异；后期叶尖、叶片边缘逐渐出现褐紫色坏死斑点，而且老叶症状重于新叶；不同位置叶片矿质元素含量分析结果表明，钾、镁和钙这3个矿质元素在新老叶片中的积累模式与BTX623有明显差异。遗传分析结果表明，该性状受2个隐性基因控制。BSA-Seq高通量测序定位，最终将该性状控制基因定位于第4条染色体上7.61 Mb区间内。该特异种质高粱的研究，为高粱钾相关分子机制研究提供了重要的基础数据。