地黄—大蒜轮作对大蒜生长及地黄化感自毒作用的影响

钮颜宇，郭志祥，徐淑慧，孙香荣，洪利亚，王丰青，张重义，李 娟

(1.河南农业大学农学院，河南郑州 450000；2.福建农林大学作物科学学院，福建福州 350002)

在根类中药材生产栽培过程中，连作障碍是影响药材产量和品质的一个非常严重的问题。地黄(Rehmanniaglutinosa)是应用广泛的大宗中药材之一，其种植过程中连作障碍问题尤为突出，研究发现连作使地黄叶绿素含量降低，光合能力下降，块根不膨大[1]。连作地黄根区有益菌种数量降低，真菌和放线菌数量增加[2-3]。目前对地黄连作障碍的研究多集中在分子形成机制方面[4-7]，可应用于实际生产的消减措施的研究较少，参考其他根类药用植物消减连作障碍的研究发现，通过运用合理轮作模式可以有效缓解连作障碍，但研究主要侧重于轮作对连作障碍作物的影响上，而对选取轮作作物本身的产量和品质鲜少研究。一种合理的轮作模式要在农业生产系统中推广，轮作作物的经济效益也是必须考虑的因素之一。

大蒜(Alliumsativum)具有广谱杀菌作用，大田生产中常被用来作为前茬作物，研究人员通过鉴定发现大蒜根系分泌物为邻苯二甲酸二丁酯、2，6-二异丙基苯酚等酚类物质以及二烯丙基二硫化物[8]，其中二烯丙基二硫化物为大蒜挥发油中的典型物质。研究表明酚类物质能够有效防止病虫害发生，大蒜根系分泌物主要成分对细菌引起的根腐病、枯萎病有显著抑制作用[9-12]。在膜侧栽培模式下，大蒜与当归间作，能有效改变土壤微生物数量，提高土壤酶活性，改善土壤理化性质，缓解当归连作障碍[13]。前期研究结果也表明，地黄与大蒜间作可以减少连作地黄的死亡率，大蒜或可作为消减地黄连作障碍的倒茬作物[14]。

为了探究地黄—大蒜轮作模式的可行性，本研究对地黄—大蒜轮作模式下，大蒜的生长指标、产量品质以及土壤指标变化进行了分析，并通过根区土壤化感效应测定及地黄苗盆栽试验研究轮作大蒜后对地黄化感自毒作用的影响，以期对后期的田间试验进行结果预估，为建立通过合理轮作模式缓解地黄连作障碍提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试大蒜品种及样品采集 试验地位于国家“2011计划”河南农业大学原阳基地，大蒜品种选用紫皮大蒜，田间试验以地黄—大蒜(2020年种植过地黄品种温85-5的茬地)作为处理组，以玉米—大蒜(前茬为玉米，8年内未种植过地黄的土壤)作为对照组，试验设3次重复，分别测定土壤基础氮磷钾含量，并通过施肥补齐。于2020年10月20日播下蒜种，一垄双行，垄宽0.4 m。行距 20 cm，株距10 cm。进行常规田间管理。分别在大蒜幼苗期、生长期、成熟期、收获期4个时期进行取样，每个重复按照3点取样法，各取30株。试验在2020年10月至2021年5月进行。

1.1.2 土壤样品采集 地黄收获期，采集根区5～20 cm范围内的土壤，用无菌自封袋装好后带回实验室，碾碎分别过20目、50目筛，除去草根等杂质后阴凉风干，备用。按照以上方法在取样期分别取对照组与处理组大蒜的根区土壤。另取地黄根区土壤(2020年种植地黄的土壤)、地黄大蒜轮作根区土壤以及空白对照土壤(取8年及以上未种植过地黄的土壤)进行盆栽试验，碾碎过20目筛除去石子、杂草等杂质，阴凉风干后储藏备用。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 生长指标 用卷尺测量株高、叶长、叶宽，用游标卡尺测量茎粗。收获期，全小区收获紫皮大蒜，风干表皮后称质量，折算单产。

1.2.2 生理指标 将收获期紫皮大蒜用硫酸蒽酮法测可溶性糖含量，考马斯亮蓝染色法测可溶性蛋白含量。

1.2.3 质量指标 按照《中华人民共和国药典》(2020年版)要求测可溶性浸出物含量，高效液相色谱法(HPLC)测大蒜素含量。色谱条件：色谱柱为AglientZORBAXSB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长214 nm；进样量20 μL；流速1.0 mL/min；以甲醇与0.2%甲酸水作为流动相进行等度洗脱，柱温30 ℃。

1.2.4 土壤指标 (1)土壤酶活性。脲酶活性测定采用苯酚钠-次氯酸钠比色法，蔗糖酶活性测定采用3，5-二硝基水杨酸比色法。(2)土壤酚酸。参考李培栋等的方法[15]提取土壤酚酸，称25 g鲜土于离心管中，加入25 mL 1 mol/L NaOH放置过夜，次日振荡30 min，离心后过滤离心液用12 mol/L的盐酸酸化至pH值为2.5，2 h后离心除去胡敏酸，而后将上清液过 0.22 μm 的纤维素薄膜，滤液用HPLC测定(重复3次)。结果按照烘干土质量换算。色谱条件：色谱柱为SunFire C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；检测波长260 nm；流速1 mL/min；进样量20 μL；柱温28 ℃；甲醇(A)-0.2%冰乙酸水(B)系统，梯度洗脱(0～16 min，15%～20%甲醇；16～32 min，20%～32%甲醇)。

1.2.5 根区土壤中化感物质的提取 取上述重茬土、地黄—大蒜轮作土和对照土各2 000 g，按照土水比为1 g∶2 mL的比例浸泡于烧杯中，搅拌均匀后浸泡过夜，超声2 h，取上清液过滤，以4 000 r/min离心20 min，40 ℃旋转蒸发浓缩滤液至40 mL，即得根区土壤水提液母液，置于冰箱备用。

1.2.6 根区土壤化感效应测试 以纱布-滤纸-培养皿法进行种子生物测试，取“1.2.5”节中制备的根区土壤水提液母液进行稀释，均分别设置50.00、25.00、12.50、6.25、0 g/mL(空白组用蒸馏水代替提取液)5个浓度，每个浓度重复3次，每次重复供试60粒地黄种子，试验前用1%次氯酸钠水溶液处理地黄种子。分别向培养皿内添加5 mL不同浓度的水提液，置于温度为28 ℃，光照度为 12 000 lx 左右的人工气候培养箱内，每天光照 12 h，相对湿度恒定。每天观察种子发芽情况，种子生长周期为10 d，自发芽后每天定时统计发芽数，10 d 时测量种子茎长与根长。

1.2.7 地黄苗生长及根系形态的测定 取上述地黄根区土壤、地黄轮作大蒜后根区土壤以及空白对照土壤按照每盆500 g分装至10 cm×10 cm的方盆，每组处理均重复4次，每个重复5盆，每盆定植4株地黄种子苗(2叶期)，于定植30、60、90 d时统计死亡数，在90 d时破坏性取样，用根系扫描仪测定各处理地黄苗根系形态。

1.2.8 数据统计分析 利用Excel 2016软件进行数据分析，采用SPSS Statistics 21.0数据处理软件对各指标进行分析。

2 结果与分析

2.1 地黄茬口对大蒜生长的影响

2.1.1 地黄茬口对大蒜农艺性状的影响 由图1可知，处理组大蒜4个时期的长势均优于对照组大蒜。收获期时，处理组大蒜的株高、茎粗、叶长，分别比对照组大蒜提高27.14%、18.03%、50.46%，差异均达到极显著水平。

2.1.2 地黄茬口对大蒜发育状态的影响 由表2可知，处理组大蒜的蒜头横径、纵径分别高出对照组大蒜6.60%、9.23%，差异显著，处理组大蒜的蒜头鲜质量高出对照组大蒜10.45%，处理组间无显著差异。

表2 地黄茬口对大蒜的发育状态及产量的影响

2.1.3 轮作处理对大蒜品质及生理指标的影响 由表3可知，2组大蒜素的含量均满足且高出《中华人民共和国药典》(2020年版)要求，其中对照组大蒜素含量为0.25%，处理组大蒜素含量为0.29%，高出对照组16.00%，差异不显著。

表3 地黄茬口对大蒜品质及生理指标的影响

2.2 轮作处理对根区土壤的影响

2.2.1 轮作处理对土壤酶活性的影响 由图2可知，处理组与对照组土壤蔗糖酶活性在整个生育期呈现先升高后降低再升高的趋势，与种植前相比分别提升33.90%、7.27%，差异极显著。处理组与对照组土壤脲酶活性在生育期内均呈先升高后降低趋势，处理组土壤脲酶活性在幼苗期达到最大值 2.59 mg/(g·h)，高出种植前108.04%，生长期、成熟期与收获期土壤脲酶活性相对减弱，但与种植前相比仍显著提升。

2.2.2 轮作处理对土壤酚酸含量的影响 土壤酚酸色谱分析结果见图3，定量分析结果见表4。由表4可知，与种植前相比，处理组对羟基苯甲酸、香草酸与丁香酸含量均显著升高；阿魏酸含量极显著提升，处理组在幼苗期提升475.00%，达到种植前5.75倍水平。香豆酸含量均极显著降低，含量降低水平最高达到39.20%；对照组对羟基苯甲酸含量在幼苗期达到最高水平 0.14 μg/g，之后逐渐降低，在成熟期、收获期未检测到对羟基苯甲酸。与种植前相比，对照组土壤新增了香草酸与丁香酸2种酚酸物质；种植大蒜后在对照组与处理组中均未检测到咖啡酸。

表4 根区土壤酚酸含量的变化 μg/g

2.3 轮作前后土壤水提液化感效应研究

2.3.1 根区土壤水提液对地黄种子萌发的影响 由图4可知，添加12.50、25.00、50.00 g/mL浓度时，轮作组地黄种子发芽势高于组内空白对照以及对照组和处理组。添加浓度为12.50、50.00 g/mL时，发芽率较空白对照分别提升8.73%、9.53%，差异不显著。添加12.50、25.00、50.00 g/mL浓度时，轮作组地黄种子发芽率均高于另外2组处理，添加浓度为50.00 g/mL时差异极显著，差异最大值达68.28%。除组内空白对照，对照组发芽势和发芽率随添加浓度增加而逐渐降低；除添加6.25 g/mL浓度外，处理组另3个浓度发芽势较组内空白对照降低，处理组组内空白对照发芽率显著高于添加12.50、25.00、50.00 g/mL浓度时的发芽率。

2.3.2 根区土壤水提液对地黄种子生长的影响 由图5可知，不同浓度下，3组处理茎长均整体呈现随提取液浓度提升而增加的趋势；同一浓度下，轮作组地黄茎长小于其他2组。3组处理地黄根长均随添加浓度的提升呈现先升高后降低的趋势；添加6.25、12.50、50.00 g/mL浓度时，轮作组根长小于其他2组，且在添加浓度为6.25 g/mL时根长与其他2组差异极显著，与对照组根长差值最大，可达1.50 cm。化感测试结果表明，轮作后土壤对地黄种子的根长、茎长均有抑制作用。

2.4 轮作处理对地黄苗期生长的影响

2.4.1 轮作处理对地黄苗死亡率的影响 由图6可知，随时间增长，地黄苗死亡率为轮作组>重茬组>对照组。生长60 d时，轮作处理后土壤对地黄苗的影响急剧增强，90 d时死亡率为47.5%，比同期地黄根区土死亡率高出90.00%。

2.4.2 轮作处理对地黄苗地下部分鲜质量的影响 由图7可知，地黄苗地下部分鲜质量为对照组>轮作组>重茬组，处理间具有显著性差异；地黄苗期产量为对照组>轮作组>重茬组，对照组产量极显著高于重茬组与轮作组。

2.4.3 根区土壤对地黄苗根系形态的影响 由表5、图8可知，从投影面积、根表面积和总根体积3个方面分析，均为对照组>轮作组>重茬组，处理组之间有极显著差异，轮作大蒜处理后根区土壤对地黄苗期地下部分生长的抑制作用减弱；各处理根系平均直径之间均无显著性差异；从根尖数量分析，轮作组的根尖数量较大，与对照组相比具有极显著差异，重茬组的根尖数量大于对照组，二者之间无显著性差异。

表5 地黄苗期根系扫描分析结果

3 讨论与结论

合理轮作能够减轻连作障碍，改善土壤环境，丰富土壤微生物群落，增强土壤相关酶活性，可减轻连作障碍植物复种时的自毒作用[16]。大量资料表明，现代农业生产提倡采用轮作模式代替单季作物，提高作物产量，稳定土壤肥力，提升土地利用率，减少病虫害[17-19]。研究地黄茬口对大蒜生长发育以及产量品质的影响，结果表明，处理组大蒜地上部分生长与发育状态较好，产量品质均有一定程度提升，大蒜素含量略高于对照组，其抗菌消炎抗肿瘤的效果更好，临床疗效、经济效益更高。

土壤酶是土壤中动植物和微生物活动的产物，是数量极微、作用极大的土壤组成部分，土壤酶的活性可以反映土壤生态状况下生物化学过程的相对强度，测定相应酶的活性，可以间接了解该物质在土壤中的转化情况，作为判断土壤生物化学过程的强度及评价土壤肥力的指标之一[20]。脲酶是土壤酶中唯一对尿素的转化有重要影响的酶，尿素只有经过脲酶水解才能被作物吸收[21]。蔗糖酶参与土壤中碳水化合物的转化，使蔗糖水解为葡萄糖和果糖被植物及微生物利用。蔗糖酶的活性强弱能够反映土壤熟化程度和肥力水平[22]。本研究结果表明，与种植前相比，处理组与对照组土壤蔗糖酶活性均有一定程度提升，间接活化土壤养分，改善土壤肥力，与前人研究结果[23]相类似。在整个种植过程中，脲酶活性呈下降趋势，对照组土壤脲酶活性减弱至种植前的53.52%，而轮作处理组土壤脲酶活性虽然较种植前提升了21.76%，但相比幼苗期的脲酶数据，仍然是降低的，推测种植初期，大蒜植入对地黄茬地土壤的脲酶活性起促进作用，但在大蒜生长过程中，土壤中的脲酶活性逐渐降低。轮作处理后土壤酶活性显著升高，预计为后茬地黄带来较高的土壤肥力，使地黄在连作环境下，保持相对较高水平的肥料利用率。

近年来，土壤酚酸类物质作为连作障碍产生的主要因素被广泛研究，前期研究表明，外源添加酚酸类物质引起的地黄化感效应有所差异，添加单体酚酸丁香酸与混合添加香豆酸、丁香酸对地黄生长影响较大，对地黄苗成活率，地黄根系膨大以及根系活力均有显著抑制作用[24]。本研究结果表明，轮作大蒜处理后，处理组对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、阿魏酸含量均显著提升，香豆酸含量降低38.69%，咖啡酸损失。对照组香豆酸含量降低25.91%，咖啡酸、对羟基苯甲酸2种酚酸物质损失，新增香草酸、丁香酸2种酚酸物质，阿魏酸含量提升258.62%。地黄茬口轮作大蒜后，根区土壤酚酸含量以及种类均发生变化，但总体含量呈上升趋势。综合根区土壤盆栽试验结果，轮作后能够提高地黄种子发芽率，但对幼苗生长具有抑制作用，或受轮作后酚酸尤其是丁香酸含量提升的影响。

本试验通过田间试验证明地黄—大蒜轮作提高了大蒜的产量与品质，改善了土壤环境，土壤酶活性提高，土壤酚酸含量总体上升；通过土壤盆栽试验表明轮作后土壤对地黄苗期地下部分的抑制作用减弱，但地黄苗死亡率较高，同期进行的地黄—大蒜轮作后复种地黄的大田试验，也同样存在地黄出苗率不高的问题。由于受到2021年强降水影响，田间试验被迫停止。大蒜轮作后对地黄化感自毒的具体影响还有待验证，其能否作为轮作作物有待商榷。