G蛋白耦联雌激素受体在癌症相关成纤维细胞中的活化对乳腺癌转移的作用及其中药干预研究

何悦双 刘 姣 颜 倩 杨佳迪 陈 梦 赵丕文

(1 北京中医药大学生命科学学院,北京,100029; 2 北京中医药大学中医学院,北京,100029)

2021年2月2日,据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)公布,2020年全球确诊癌症的患者达1 930万例,而死于癌症的人数增加到1 000万。其中乳腺癌是全球最常见的癌症,在新增癌症病例中占11.7%。乳腺癌多发于40～55岁的女性,其具有靶向差、难治性高、易于转移等特点,严重威胁着人类的健康。癌症相关成纤维细胞(Cancer-associated Fibroblasts,CAFs)是癌症基质的重要活性成分,不但参与了乳腺癌的启动和进展,在其转移和复发过程中也发挥着重要作用。同时研究发现,CAFs是雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)阳性细胞,ER介导效应与CAFs功能及由其调节的癌细胞迁移密切相关[1]。近年来研究发现,除雌激素核受体ERα和ERβ外,另有一种膜雌激素受体——G蛋白耦联雌激素受体(G Protein-coupled Estrogen Receptor,GPER)也可介导雌激素的相关效应,但与核受体ERα和ERβ主要介导基因组调节效应相比,GPER主要介导多种快速非基因组调节效应[2]。在CAFs中雌激素经GPER介导触发了一系列信号转导通路,并将进一步影响癌细胞的增殖和转移[3]。

已有研究发现,一些中药单体不仅可以通过直接抑制癌细胞的增殖而发挥抗肿瘤效应,也可通过调整肿瘤微环境的稳态抑制肿瘤的增殖和转移,具有降低化疗和放疗危害并最终延长患者的生存时间等优势[4]。中药单体可以通过抑制CAFs中相关因子的释放,进而阻止乳腺癌上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal Transition,EMT)的发生,从而抑制乳腺癌的转移。因此,本文总结了GPER与CAFs与乳腺癌发生、发展和转移之间的关系,以及中药单体作用于CAFs进而抑制乳腺癌的增殖和转移的分子机制。

1 CAFs的功能及其在乳腺癌细胞增殖和转移中的作用

成纤维细胞是结缔组织的主要细胞成分,在癌症进展的所有阶段均与癌细胞相关[5]。在乳腺癌中,约80%的基质成纤维细胞为CAFs,其活化表型可促进乳腺癌细胞的增殖,并可在与原发肿瘤相似的转移部位生长,是原发肿瘤微环境(Tumor Microenvironment,TM)中最具有代表性的细胞类型。CAFs主要由固有结缔组织的成纤维细胞被癌细胞侵袭激活后产生,对癌症的发生、发展及转移都具有重要影响,可以促进癌细胞生长、侵袭和免疫抑制[6]。

研究发现,在肿瘤发生之初,CAFs与正常成纤维细胞一样,可以被肿瘤细胞分泌的生长因子募集到肿瘤基质中,用以修复受损组织并抑制肿瘤细胞的侵袭。然而随着肿瘤的发展,CAFs继续积聚细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)蛋白、分泌生长因子并收缩和重塑ECM。CAFs自身也可以通过分泌生长因子和细胞因子[6-9],募集免疫细胞促进肿瘤进展[5,10],例如CAFs分泌的白细胞介素-32(Interleukin-32,IL-32)通过促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK)信号转导促进乳腺癌细胞侵袭和转移[11],IL-33可以在转移性TM中引发2型炎症,进而促进乳腺癌肺转移等[12]。同样也能降解和重塑ECM成分,促进EMT过程和诱导干细胞分化[7-10]。CAFs还可以通过直接接触癌细胞,将癌细胞拉离原发肿瘤灶,以促进癌症的转移[13]。

大量临床数据和动物实验结果均证明了癌症包块内聚集的CAFs在癌症进展中起作用以及基质微环境对抑制癌症发展的贡献[14-15]。此外,间质成纤维细胞可能促进局部产生雌激素,甚至通过与重要的转导通路(如被生长因子激活的通路)的串扰进一步刺激了乳腺癌肿块的生长[12]。所以如何通过抑制CAFs的增殖从而减少癌细胞的增殖、黏附和扩散或可成为癌症防治的新策略。

2 GPER在乳腺癌CAFs中的定位及意义

GPER多定位在细胞膜上,在多种亚细胞结构,如内质网、高尔基体、核糖体以及细胞核中也有存在[2]。在CAFs中,GPER定位于乳腺CAFs的核内,雌激素在CAFs的核内刺激GPER和磷酸化EGFR之间的相互作用,从而导致基因转录和相关的生物学反应[16]。PUPO等[17]和LAPPANO等[18]通过电子显微镜观察确定了GPER定位于从乳腺癌患者中提取的CAFs的核室中,首次证明了在GPER序列中存在一个假定的核定位序列(Nuclear Localization Sequence,NLS),它以输入蛋白(Importin)依赖性方式调节CAFs中的受体核易位。在雌激素的作用下,GPER通过与靶基因c-fos的启动子区域内假定的ATRS基序结合,介导c-fos和结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor,CTGF)的上调,NLS参与GPER的核输入,GPER通过输入蛋白依赖性机制转移到细胞核中。

GPER在乳腺癌中可从胞浆膜逆行转运进入细胞内的下级结构,最终定位于细胞核周围[17],表明GPER在细胞功能改变时,以一种“来回穿梭”的形式存在于细胞内,这样的“胞浆转位”现象在乳腺癌CAFs中也存在。生理状态下的TM是一个非常复杂的结构,所以CAFs可能受到其中多种成分的影响,肿瘤实质细胞与CAFs是乳腺癌细胞中重要的组成部分,所以在体内环境中乳腺癌细胞可能影响CAFs中GPER的细胞内定位。余腾骅等[19]证明单独培养的GPER定位于CAFs的细胞核,与人乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-468细胞共培养后,细胞中的GPER出现胞浆转位,雌激素和G1处理后,共培养条件下的CAFs中的成纤维细胞生长因子2(Fibroblast Growth Factor 2,FGF2)含量均明显增加,且2种乳腺癌细胞的增殖能力增强,FGF2中和抗体可使该现象不出现,证明了CAFs中GPER的胞浆转位现象有利于雌激素/GPER/FGF2通路的活化,从而可能促进乳腺癌的进展。

迄今为止,GPER在细胞核中的功能仍有待充分验证。研究表明,这些受体具有与膜相关蛋白相互作用的能力,使膜相关蛋白易位到细胞核中,并能调节基因转录[20-22]。通过单分子NLS进行的GPER核区室化可以更好地理解该受体的生物学特性,也为诠释其调节基因转录的可能性开辟了新途径。

3 GPER在CAFs中活化后对乳腺癌增殖和转移的影响

关于CAFs中GPER活化后对癌细胞发生和迁移行为的影响是近几年该领域的研究热点之一。CAFs能够通过TM中释放的相关因子,维持癌细胞的生长、侵袭和转移[23-24],而GPER介导相关因子的表达,也对癌细胞的增殖起到关键作用。

CAFs为癌细胞提供了支持其侵袭、扩散的微环境[24-27]。YANG和YAO[28]发现与正常成纤维细胞(Normal Fibroblast,NF)相比,CAFs可以促进MDA-MB-231细胞的增殖,迁移和侵袭。1型胶原蛋白(Collagen-1,coll-1)是TM因子之一,可调节癌细胞的生存、增殖、转移和侵袭。CAFs中Coll-1的表达量与GPER的表达量正相关,GPER的下调抑制Coll-1的表达,从而诱导了细胞增殖的减少、S期的阻滞和MDA-MB-231细胞迁移与侵袭的抑制。证明了CAFs中GPER的上调可以促进三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer,TNBC)的增殖,侵袭和迁移;而GPER的下调对TNBC癌细胞的作用相反,且GPER的表达水平与TNBC的预后正相关[29]。

研究表明,类固醇受体和生长因子受体之间的功能性相互作用对乳腺癌的进展起着至关重要的作用[30-32]。Notch信号转导通路是一种经典的细胞间通信机制,在许多细胞类型和不同发育阶段起作用,在哺乳动物发育过程中,Notch信号控制着器官发生的各个方面,包括神经发生、血管发生、肌发生和造血等[32],研究表明,Notch通路的失调与癌症干细胞更新、血管生成和化学抗性有关。雌激素在GPER和Notch通路之间进行正向串扰,在CAFs中GPER参与了Notch依赖性转录,触发了Notch/Snail信号通路,从而引起EMT的发生[33]。证明了Notch信号通路介导了乳腺癌细胞和CAFs中雌激素GPER信号通路,且雌激素可通过该机制刺激乳腺癌的进展。

GPER是缺氧诱导因子1α(Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α)的转录靶点,并在缺氧性乳腺TM中激活血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)表达和血管生成,有资料显示,具有血管生成作用的胰岛素样生长因子1(Insulin-like Growth Factors,IGF1)/胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)信号转导可激活乳腺癌细胞中的GPER。ERNESTINA M等[34]分析了近5 000例乳腺癌患者的基因表达数据,并使用来自患者乳腺肿瘤包块的原代CAFs细胞,研究GPER在调节IGF1触发的VEGF表达和血管生成中的作用,确定了IGF1/IGF1R信号转导参与细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)和蛋白激酶B(AKT)转导通路来诱导HIF-1α,也影响了其靶点GPER和VEGF的表达。HIF-1α和GPER之间的功能合作对于IGF1诱导的VEGF的转录激活至关重要,HIF-1α和GPER都参与了VEGF诱导的人血管内皮细胞管形成。

CIRILLO等[35]发现,一种具有致癌作用的环境污染物3-甲基胆固醇(3-methylcholanthrene,3MC),可通过SkBr3细胞和CAFs中的芳香烃受体(Aryl Hydrocarbon Receptor,AHR)和GPER激活人表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)/细胞外信号调节激酶(Extracellular Signal-regulated Kinases,ERK)/c-Fos信号转导通路,上调细胞周期素(Cyclin)D1/A/E,从而刺激乳腺癌SkBr3细胞和CAFs,促进乳腺癌的发展。

总体而言,GPER活化后介导了一系列的信号转导通路,促进了CAFs释放相关因子,进而对乳腺癌细胞的增殖和转移起到一定的作用,这些发现为利用TM靶向治疗乳腺癌提供了新方向。

4 雌激素作用于乳腺癌CAFs的GPER介导机制

作为乳腺癌发展的关键因素,CAFs参与了与癌症相关的转移行为,包括释放各种生长因子、细胞因子、蛋白酶和激素(包括雌激素)介导的增殖、转移和侵袭。实际上,雌激素是乳腺癌微环境中的活跃分子,在生理和病理生理条件下都影响着乳腺癌基质,如CAFs等的活性和行为,GPER可以作为该细胞应答雌激素相关效应的重要介导者[36]。CAFs可在生理水平雌激素作用下,快速诱导ERK的磷酸化和早期基因如c-fos和结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor,CTGF)以及Cyclin D1的表达,且上述效应由GPER介导[37]。

GPER通过激活EGFR信号通路发挥作用,介导多种信号通路[38]。GPER的激活可导致肝素结合生长因子(Heparin Binding Epidermal Growth Factor,HB-EGF)的释放,进而触发EGFR/ERK通路的转导[39]。CAFs中的GPER活化后可介导雌激素对癌症相关基质的作用,并且CAFs可能通过GPER/EGFR/ERK信号转导通路与雌激素产生的正反馈回路来促进乳腺癌的进展,特别是肿瘤相关巨噬细胞抗性[40]。

LUO等[41]观察到雌激素以及G1以剂量依赖的方式触发乳腺癌CAFs瞬时细胞指数升高,这一促进作用可以被GPER选择性拮抗剂G15阻断,证明GPER介导了乳腺癌CAFs中的黏附/扩散、增殖和迁移,雌激素可能会影响与癌症相关的基质,并通过CAFs促进乳腺癌的发展。LUO等[42]还发现,尽管MCF-7的CAFs中,雌激素的效应更多地与ERα介导作用相关,但也观察到GPER触发的快速信号转导过程可调控雌激素效应基因,如c-fos、B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Cyclin D1/A/E、CTGF和早期生长反应因子1(Early Growth-Response Factor 1,ERR-1)等的表达。因此,可以证明CAFs中的GPER活化后与乳腺癌细胞的增殖、学抗性和转移有关。

前文提到余腾骅等[19]证明乳腺癌CAFs中雌激素/GPER/蛋白激酶A(PKA)/FGF2通路可能在癌症转移中发挥重要作用。SANTOLLA等[43]发现,经过雌激素刺激后的CAFs的条件培养基与MAD-MB-231细胞共培养,激活了FGF2/成纤维细胞生长因子受体1(Fibroblast Growth Factor Receptor 1,FGFR1)旁分泌信号,促进了CTGF的表达,导致MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。证实了雌激素和GPER激动剂G1通过GPER-EGFR-ERK1/2通路诱导了FGF2的上调和分泌,从而激活ER阴性乳腺癌CAFs中的GPER/EGFR/ERK/c-fos/激活蛋白-1(Activator Protein1,AP-1)信号转导级联。FGFR1是最常扩增的FGFRs家族成员,其扩增/表达与乳腺癌患者的生存率下降相关,通过以上发现表明,GPER与FGF2/FGFR1旁分泌激活转导机制相关,可能促进乳腺癌的发展。

沉默调节蛋白的表达在许多癌细胞中会发生改变,有研究发现,在乳腺癌细胞中,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)+依赖的组蛋白脱乙酰基酶沉默信息调节因子1(Silence Information Regulator1,SIRT1)对由ERα介导的致癌信号转导通路发挥着至关重要的作用。SANTOLLA等[44]确定了在SkBr3细胞和CAFs中,雌激素和G-1可以通过GPER诱导SIRT1的表达,并继续激活EGFR/ERK/c-fos/AP-1转导通路,因此推测SIRT1可能包含在由雌激素通过GPER促成乳腺癌进展的转导网络中。

因为雌激素是乳腺细胞外基质循环调节的主要驱动力,癌细胞的发展又受到多种因素和机制的影响,而雌激素和CAFs在癌症进展中起着至关重要的作用,因此了解雌激素及其受体和CAFs在癌症发生和转移中的作用将旨在创新抗癌策略,寻找癌症治疗新靶点开拓更广阔的前景,通过调节雌激素作用于TM或可成为治疗乳腺癌的新思路。

5 中药及其活性成分作用于乳腺癌CAFs的GPER介导机制

近年来中药单体的抗癌作用已被广泛研究,有希望运用于增生性肿瘤的治疗,研究发现其抗癌效应与改善TM密切相关,可通过调节TM中的相关因子抑制癌症的发生发展。HAO等[45]证实夏枯草多糖(PVP)可以通过抑制CAFs中碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)的表达来抑制CAFs的生长和迁移,从而对乳腺癌SkBr-3细胞的增殖起到间接性抑制作用。中药单体可通过多种机制调节肿瘤基质,尤其是CAFs,从而使增生性TM正常化,以改善化学治疗药物和纳米药物的不良反应。同时,中药单体可以抑制癌症相关基质与癌细胞之间的相互作用,从而抑制癌细胞的增殖、侵袭、迁移和耐药性[46]。

YAO等[47]发现,来自中药青蒿的青蒿琥脂和二氢青蒿素可以抑制CAFs诱导的乳腺癌细胞生长和转移,也可以通过抑制转化生长因子β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)信号促使CAFs凋亡。大黄素可通过抑制CAFs分泌TGF-β阻止乳腺癌EMT的发生[48],黄连素与其有相似的效果[49],也可通过抑制CAFs分泌TGF-β,从而抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路活性抑制乳腺癌的EMT。有研究表明,在乳腺癌CAFs中,PI3K/AKT信号通路可以诱导CAFs中的GPER转运,在前文中提到CAFs中GPER的胞浆转位现象有利于雌激素/GPER信号通路活化,从而可能促进乳腺癌的进展[38];所以黄连素在CAFs中抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性可能与其经GPER介导的雌激素样作用相关。

姜黄素(二氟甲酰甲烷)是中药姜黄的一种多酚类衍生物,已被证实具有抗癌活性,可以对致癌基因表达,细胞周期调节,细胞凋亡,癌症发生和转移的多种生物学途径起作用[50-51]。姜黄素可以通过作用于CAFs进而影响胰腺癌、前列腺癌的EMT和侵袭[52]。在乳腺癌中,姜黄素可以上调CAFs中的P16、P21、P53等抑癌基因水平,并抑制JAK2/STAT3信号通路,减少旁分泌IL-6、基质金属蛋白酶-2(Matrix Metalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9、TGF-β和基质细胞衍生因子(Stromal Cell-derivedFactor1,SDF-1)等因子抑制乳腺癌细胞的侵袭/迁移[53]。磷酸葡萄糖异构酶/自分泌运动因子(Phosphoglucose Isomerase/Autocrine Motility Factor,PGI/AMF)在糖酵解和糖异生中起重要作用,并与癌细胞的侵袭和转移有关,能够诱导乳腺癌细胞EMT[54]。AMF可以通过降低AMF受体和GPER的水平,从而激活AKT和ERK信号通路,抑制JAK/STAT信号通路激活[55]。瘦素作为促有丝分裂因子可能在人类癌症的发生和发展过程中发挥重要作用,因此被认为是乳腺癌治疗的新方向[56]。有研究表明,瘦素基因的表达可以通过激活雌激素受体来调节,而姜黄素可以抑制瘦素基因表达和分泌,且姜黄素对瘦素的作用与ERα的表达正相关[57]。因此,姜黄素可能通过雌激素/GPER信号通路作用于乳腺癌CAFs,并抑制JAK2/STAT3信号通路发挥抗癌效应。

白藜芦醇首先在20世纪70年代首次在葡萄中发现,后来在中药虎杖和桑椹中也发现含有这种成分。白藜芦醇可以通过抑制CAFs条件培养基处理过的乳腺癌细胞分泌的cyclinD1、c-Myc、MMP-2和MMP-9等因子,从而抑制转录因子SOX2(SRY-box Transcription Factor,SOX2)的表达和AKT及STAT3的激活,使乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭被抑制[58]。白藜芦醇可以在T47D乳腺癌细胞系中,通过剂量依赖的方式引起p53的凋亡以及ER的下调[59]。白藜芦醇可以从mRNA和蛋白水平下调ER、IGF-1受体、p-AKT 1/2/3和cyclinD1的表达,抑制雌激素和双酚A(Bisphenol A,BPA)在卵巢癌细胞系BG1中的增殖[60]。双酚A可通过与ERα、ERβ或GPER相互作用,发挥类似雌激素的活性。因此,白藜芦醇在乳腺癌症中可以下调ER致雌激素效应减弱,发挥抑制癌症基质细胞增殖、抑制乳腺癌的效应。

目前,中药单体通过影响癌细胞与CAFs的相互作用对抗增生性肿瘤已经有很多实验和理论依据,但中药单体作为天然雌激素样成分与CAFs中的雌激素受体结合,从而串扰TM和癌症细胞之间的联络却少有提及。因为雌激素是乳腺细胞外基质循环调节的主要驱动子,中药单体是否可以通过雌激素/GPER信号通路对CAFs和乳腺癌胞进行串扰从而发挥抗癌作用,值得进一步深入研究。

6 讨论

近年来,由于GPER阳性细胞—CAFs可以通过分泌生长因子和细胞因子促进乳腺癌细胞的增殖和转移,而得到了广泛关注。在CAFs中,GPER定位于核室内,其活化后可以通过介导信号转导通路和增殖、迁移相关因子的表达从而影响乳腺癌的发展。而很多中药及其活性成分都被报道过可以通过作用于CAFs中的GPER介导机制从而抑制乳腺癌的发展。

CAFs是TM中的重要角色,可参与促进癌症的发生和发展。例如,CAFs可通过分泌趋化因子、生长因子而发挥旁分泌作用,进而促进增生肿瘤的侵袭性和化学治疗耐受性[61]。因此,人们在近几年的研究认识到CAFs是降低抗化疗药耐药性和癌症复发的化学疗法的较重要的靶点之一。除了抑制癌细胞的增殖外,许多中药单体还具有靶向不同类型基质细胞的能力,从而对增生性肿瘤细胞的侵袭、增殖和迁移表现出间接抑制作用。这些中药单体通常通过各种信号通路调节TM,在癌症治疗中起着全面的协调作用。近年来,GPER作为一种新型的细胞增殖、迁移介导分子已引起越来越多的关注。尤其是现已证明,GPER可以作为转录调节因子介导CAFs对雌激素的应答反应,引发细胞增殖、迁移、黏附/扩散等;GPER参与了CAFs衍生因子对乳腺癌细胞侵袭性特征的旁分泌作用,而GPER在CAFs中的胞浆转位现象更是为抑制乳腺癌的发展提供了新思路。总体而言,大量研究使人们对GPER在CAFs中的作用有了进一步的了解,关于中药单体激活CAFs中的GPER信号通路在防治乳腺癌中的应用,还需要更全面、更深入的体内外实验进行探索,以进一步揭示雌激素/GPER信号通路在癌细胞和TM中的作用,寻找和建立更高效、更具针对性的抗癌策略。

利益冲突声明：无。