高效液相色谱法检测育肥猪配合饲料中孟布酮

刘雪红

(大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁大连 116037)

孟布酮(4-(4-甲氧基萘-1-基)-4-氧代丁酸)属于动物专用利胆药[1-2]，具有刺激动物胃肠等消化液分泌的作用，适用于猪、羊、牛、马、犬等的消化不良、食欲减退、便秘腹胀等胃肠机能障碍，辅助治疗肠炎、中毒性肝功能受损及肝营养不良等疾病。长期大量使用易在动物体内残留，农业农村部公告第284号[3]公布了最高残留限量40 μg/kg(参照日本肯定列表制定)。兽药主要是预防、诊断、治疗动物疾病的物质，具有极强的针对性，能够调节动物的身体机能。但随着摄入量的增多，最终导致对人体慢性中毒[4]。根据《关于停止生产、进口、经营、使用部分药物饲料添加剂的公告》(农业农村部公告第194号[5])，允许在商品饲料中使用的兽药包括两类：抗球虫类药物和中药类药物，孟布酮是不允许添加到饲料中的。但由于孟布酮能促进胃肠内脂肪、蛋白质和淀粉等的消化吸收，调节胃肠机能，促进动物生长发育，提高生产性能，很可能被添加到饲料中[6]。目前，未查到饲料中孟布酮的检测方法[7]，本文采用WAX 固相萃取柱净化[8]，C18色谱柱分离，高效液相色谱法检测饲料中孟布酮[9]。分析速度快、回收率高，能满足育肥猪配合饲料中孟布酮检测定性、定量的要求。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 电子天平RD-200，德国 Sartorius公司；超声波清洗器KQ-250B，昆山市超声仪器有限公司；离心机CF16RN，日立公司；氮吹仪N-EVAP，美国Organomation；数显强力涡旋混合器MS3，德

国IKA公司；液相色谱质谱联用仪2695，美国Waters公司；色谱柱Sunfire C18(4.6×250 mm，5 μm)，美国Waters公司；固相萃取柱 Oasis WAX 3 mL 60 mg，美国Waters公司。

1.2 药品与试剂

1.2.1 标准品 孟布酮(C15H14O4，CAS号：3562-99-0)批号11462103 76654，含量99.90%，坛墨质检科技股份有限公司。

1.2.2 供试品

1.2.2.1 空白样品 育肥猪配合饲料，经检测不含孟布酮。

1.2.2.2 空白添加样品 分别按照0.2 mg/kg、0.4 mg/kg、2 mg/kg的比例在空白样品中添加孟布酮，混匀。

1.2.3 试剂 甲醇、乙腈色谱纯，氨水、磷酸分析纯，水为符合GB/T 6682 规定的一级水。

1.2.3.1 0.5%磷酸溶液：量取5.0 mL磷酸于1000 mL水中，混匀。

1.2.3.2 0.5%氨水溶液：取氨水0.5 mL，加水至100 mL，混匀即可。

1.2.3.3 9%氨化甲醇溶液：取氨水9 mL，加甲醇至100 mL,混匀即可。

1.2.4 标准储备液(1 mg/mL)：精密称取孟布酮标准品10 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度。保存于-20 ℃，有效期为3个月。

1.2.5 标准中间溶液(100 μg/mL)：准确量取标准储备溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，保存于-20 ℃，有效期为3个月。

1.2.6 标准工作液：精密量取孟布酮标准中间液，用甲醇稀释成浓度为0.2、0.5、2.0、5.0、10.0 μg/mL的系列标准工作液。

1.2.7 微孔滤膜：有机系，孔径0.22 μm。

1.3 样品检测

1.3.1 样品处理

1.3.1.1 提取：准确称取饲料样品2.00±0.02 g，加乙腈10 mL，超声10 min，8000 r/min，离心10 min，取上清液。重复提取1次。合并2次提取的上清液，取上清液10 mL，50 ℃氮气吹干，残留物中加入0. 5 %氨水溶液5 mL，涡旋5 min，得到待净化液，备用。

1.3.1.2 净化：将WAX固相萃取柱依次用甲醇3 mL、水3 mL进行活化；待净化液5 mL上样；用甲醇3 mL淋洗，抽干；9%氨化甲醇溶液3 mL洗脱，抽干。收集洗脱液，50 ℃氮气吹干，加入甲醇1 mL复溶，涡旋5 min，滤过，滤液供高效液相色谱仪测定。

1.3.2 液相色谱条件 色谱柱Sunfire C18柱(4.6×250 mm，5 μm)，柱温：30 ℃，进样量：10 μL，检测波长：236 nm，流速：1.0 mL/min，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedure

2 结果与分析

2.1 标准曲线 以色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线：y=78664x-552.56，线性相关系数r为0.999 8，孟布酮的线性范围为0.2 μg/mL～10.0 μg/mL。

2.2 检测限和定量限 添加适量标准液于空白饲料中，经提取后测定。根据信躁比S/N>3为检测限，信躁比S/N>10为定量限，检测到孟布酮的检测限为0.06 mg/kg，定量限为0.2 mg/kg。空白饲料中添加0.2 mg/kg的孟布酮色谱图见图1。

图1 空白饲料中添加0.2 mg/kg的孟布酮色谱图Fig 1 Chromatogram of 0.2 mg / kg montebutone added to blank feed

2.3 回收率及重复性试验 在空白饲料中进行3浓度(0.2，0.4，2 mg/kg)回收率试验，每个添加浓度6个平行，连续测定3批，其平均回收率、相对标准偏差见表2。从表看出孟布酮的添加回收率在78.1%～90.6%之间[10]，批内批间相对标准偏差均小于10%。

2.4 稳定性试验

2.4.1 标准溶液的稳定性试验 对标准储备溶液(1 mg/mL)进行了为期3个月的稳定性试验。每次试验时，临时稀释，每周配置标准系列溶液(0.2 μg/mL，0.5 μg/mL，2.0 μg/mL，5.0 μg/mL，10.0 μg/mL)，按照上述仪器条件测定，记录峰面积，取峰面积与浓度做线性回归。共进行了14次标准曲线测定，见图2。3个月内每个浓度溶液的峰面积无显著变化。同时对储存的标准中间溶液(100 μg/mL)进行同样试验，结果一致。因此，标准储备溶液(1 mg/mL)和标准中间溶液(100 μg/mL)的保存条件均为：-20 ℃保存时间为3个月

图2 孟布酮标准储备溶液保存时间与峰面积比较图Fig 2 Comparison of storage time and peak area of montebutone standard solution

2.4.2 上机测定用标准工作液及试样液的稳定性试验 分别对标准工作溶液(2 μg/mL)和试样溶液(2 μg/mL)进行了24小时的稳定性试验。试验结果表明，室温条件下24小时内稳定，见表3。

表3 标准工作溶液及试样液稳定性试验结果Tab 3 stability test results of standard working solution and sample solution(n=6)

3 讨论与结论

3.1 流动相中有机相的确定 考察两种最常用有机相：乙腈和甲醇。结果显示，二者对孟布酮的响应及分离效果基本一致；但选用甲醇时，系统压力较高，同时噪声较乙腈大。因此，本实验选择乙腈为流动相。

3.2 流动相组成中水相的确定 考察2种水相体系对结果的影响：0.2%甲酸，0.5%磷酸，2.0 μg/mL标准溶液液相色谱图见图3和图4。结果显示以0.2%甲酸，0.5%磷酸为水相，分离效果及响应值基本一致，但含甲酸时基线向下漂移，不稳定，且有明显杂质峰。因此在上机过程中，在流动相中引入磷酸。

图3 2.0 μg/mL标准溶液液相色谱图(0.2%甲酸为流动相)Fig 3 Chromatogram of 2.0 μg/mL standard solution(mobile phase by 0.2%formic acid)

图4 2.0 μg/mL标准溶液液相色谱图(0.5%磷酸为流动相)Fig 4 Chromatogram of 2.0 μg/mL standard solution(mobile phase by 0.5% phosphoric acid)

3.3 流动相洗脱方式的确定 比较了等度(0.5%磷酸：乙腈=64：36)和梯度(表1)两种洗脱方式，考察了2.0 μg/mL标准溶液在两种洗脱方式下情况，见图4和图5。结果表明，两种洗脱方式下孟布酮与杂质都能达到有效分离，峰形好；但等度洗脱孟布酮保留时间较长为19 min，梯度洗脱保留时间为7 min。考虑试验效率，本研究选择梯度洗脱方式。

图5 等度2.0 μg/mL标准溶液液相色谱图Fig 5 Chromatogram of 2.0 μg/mL standard solution(isocratict elution)

3.4 检测波长的选择 对孟布酮2 μg/mL标准溶液进行紫外扫描，见图6，最大吸收波长为235.8 nm。本实验选择检测波长为236 nm。

图6 孟布酮光谱图Fig 6 Spectrum of menbutone

3.5 提取溶剂的选择 乙腈对大多数兽药提取效果较好，提取样品时提取液基质效应较低，而且乙腈能较好地使蛋白质凝聚变性从而沉淀蛋白；与纯乙腈相比，在提取液中加入酸，使呈酸性，提高提取效率[11]；同时考虑到甲醇对孟布酮的溶解性与乙腈类似，且其沸点较乙腈低，更易吹干浓缩。基于以上理由，比较4种提取溶剂：乙腈、0.2% 甲酸乙腈、0.5% 磷酸乙腈、甲醇。空白饲料中添加0.2 mg/kg，4种溶剂的提取效率没有显著差异。但甲醇为提取溶剂时，提取液杂质较多、混浊呈淡黄色，过固相萃取柱困难，净化时间长，因此本研究选择乙腈为提取溶剂。

3.6 提取次数选择 比较提取液量10 mL，提取1、2、3次。3种添加浓度下孟布酮回收率及重复性情况(0.2 mg/kg，0.4 mg/kg，2 mg/kg)，每水平添加重复三次，效果见表4。提取1次，在添加较低浓度(0.2 mg/kg和0.4 mg/kg)时，回收率及RSD均满足要求；但较高浓度2.0 mg/kg，回收率小于70%，且重复性差。当提取2次与3次时，3种添加水平回收率和RSD均满足要求，选择提取2次。

表4 不同提取次数考察结果表Tab 4 Investigation results of different extraction times

3.7 离心速度与时间的确定 WAX固相萃取柱较常用的HLB、MCX固相萃取柱，溶液过柱时间长，离心的效果对净化时间影响很大。如果离心转速低、时间短，净化时间太长，影响试验；因此未选择低转速、短时间试验。离心时间10 min的情况下，比较了4种离心速度：6000 r/min，7000 r/min，8000 r/min，9000 r/min，提取情况见表5。回收率没有显著差异。但前两种转速下净化时间大概需要50分钟，后两种转速下净化时间约30分钟。因此选择8000 r/min，离心10 min。

表5 不同离心速度考察结果表Tab 5 Investigation results of different centrifugal speeds

3.8 氮吹温度选择 比较5种氮吹温度：35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃，对结果的影响。不同氮吹温度之间提取效率没有显著差异，回收率均大于70%。不同氮吹温度所用时间情况见图7。考虑效率和成本，本实验选择50 ℃氮吹。

图7 氮吹温度与时间Fig 7 Nitrogen blowing temperature and time

3.9 复溶液的比较 考察3种溶剂下的复溶效率：0.5%磷酸-乙腈溶液(64∶36)、乙腈、甲醇。分别考察3种添加浓度下孟布酮回收率情况(0.2 mg/kg，0.4 mg/kg，2 mg/kg)，效果见表6。利用甲醇作为复溶液，3个水平添加孟布酮的回收率都大于80%，满足要求。本研究选择甲醇作为复溶液。

表6 不同复溶液考察结果Tab 6 Investigation results of different complex solutions

3.10 实际样品检测 对2021年市监督抽查的16家企业的22批育肥猪配合饲料进行检测，均未检出孟布酮。

3.11 结论 该检测方法，定量限为0.2 mg/kg，在0.2，0.4，2 mg/kg添加水平下，育肥猪配合饲料中孟布酮平均回收率为78.1%～90.6%，相对标准偏差均小于10%。实验流程简单、快速、有效，适合大批量日常分析检测。