一株鸡传染性喉气管炎病毒流行毒株的鉴定与致病性分析

王静文，张 敏，陈 玲，杨承槐，蒋桃珍

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis, ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一种鸡的急性、高度接触性呼吸道传染病，以呼吸困难、气喘、咳出血样渗出物为临床特征，病理剖检常见气管与喉头黏膜细胞肿胀、糜烂和出血，严重影响鸡群的生长和发育以及生产性能[1]。该病1925年最早发生于美国[2]，我国最早报道见于贵州省。该病以往多发于蛋鸡和种鸡，近些年随着我国养鸡业蓬勃发展，商品肉鸡中亦普遍发病。弱毒疫苗虽然存在着毒力返强、潜伏感染等诸多缺点，目前仍是防控ILT的主力军，主要包括鸡胚源和组织细胞源两种[3-5]。

检验用强毒在活疫苗评价试验中的重要性不言而喻[6]。美国药典规定，攻毒后观察10日，至少80%攻毒对照鸡应出现死亡或严重临床症状[7-8]；欧洲药典规定，攻毒后观察7日，至少90%攻毒对照鸡应出现死亡或严重临床症状[9]。《中国兽用生物制品规程》(2000年版)中界定的鸡传染性喉气管炎病毒强毒株的标准为5只攻毒至少3只出现严重眼炎、咳嗽、喘气等临床症状；《中国兽药典》中写明，按照104.0EID50/只的攻毒剂量，10日内4只攻毒对照鸡应至少3只出现眼炎和呼吸道症状；《兽药质量标准》(2017年版)生物制品卷中指出，喉囊内接种ILTV王岗株104.2EID50/只，10只攻毒对照鸡至少7只发病[10]。然而，目前库存王岗株毒力普遍偏弱，不能有效满足ILT活疫苗评价需求，因此亟需一株毒力更强、更稳定的ILTV强毒株。

本研究对一株ILTV流行毒株冻干物进行了系统鉴定，包括纯净性、病毒含量、特异性、真空度等，重点关注其作为检验用强毒在致病力方面的表现，为 ILT疫苗的效力评价奠定基础。

1 材 料

1.1 毒株 鸡传染性喉气管炎病毒江苏株(ILTV JS株)由哈尔滨兽医研究所刘胜旺研究员馈赠提供。

1.2 试剂 生理盐水、5%蔗糖牛奶、无菌培养基、支原体培养基购自北京中海生物有限公司；外源病毒检测试剂盒购自IDEXX公司；冻干保护剂(主要成分蔗糖、明胶、水解乳蛋白等)、胰蛋白胨磷酸盐肉汤(TPB)、ILT阳性血清由实验室制备保存。

1.3 实验动物 SPF鸡胚、SPF鸡均购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。

2 方 法

2.1 毒种繁殖 将ILTV JS株用TPB溶液10倍稀释后，经绒毛尿囊膜接种10日龄SPF鸡胚50枚，0.2 mL/枚，37 ℃孵育120 h。无菌剪取出现增厚及痘斑的绒毛尿囊膜，高速匀浆研磨后加入10倍体积的TPB溶液。无菌检验合格后作为冻干用毒液，置于-70 ℃保存。

2.2 毒种冻干与封口 将待冻干病毒液分为两批，一批与5%蔗糖脱脂牛奶等量混合；另一批与自制冻干保护剂按照2 ∶1比例混合，无菌分装于安瓿瓶后立即置于冻干机内按常规程序进行冻干，随后抽真空、火焰烧熔封口。将冻干毒种置于-70 ℃保存待检。

2.3 性状观察 肉眼观察冻干培养物在安瓿瓶内的状态，轻轻振荡观察是否易与瓶壁脱离，以及加入稀释液后的溶解情况。

2.4 无菌与支原体检验 随机抽取10支冻干培养物，按照《中国兽药典》附录 3306和附录3308进行无菌检验和支原体检验。

2.5 病毒含量测定 随机抽取3支冻干培养物，用TPB溶液复溶至原体积后进行10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6四个稀释度各经绒毛尿囊膜接种5枚10日龄SPF鸡胚，每枚0.2 mL，同时设TPB溶液对照组。置37 ℃孵育120 h。到期后，打开鸡胚外壳，观察记录绒毛尿囊膜出现灰白色痘斑或增厚的鸡胚数，按照Reed-Muench法进行病毒含量计算。冻干后24个月，再次随机抽取各3支冻干培养物，按上述方法进行病毒含量测定。

2.6 特异性检验 随机抽取1支冻干培养物，用灭菌生理盐水稀释至200 EID50/0.1mL。取1.5 mL与等体积的ILT阳性血清混合，室温作用1 h(期间振摇1次)，经绒毛尿囊膜途径接种10枚10日龄SPF鸡胚，每胚0.2 mL，同时设置病毒对照组和生理盐水对照组。置于37 ℃孵育，24 h内死亡鸡胚弃去不计，观察记录24～120 h鸡胚存活和出现痘斑发育情况。

2.7 外源病毒检验 随机抽取1支冻干培养物，用生理盐水作10倍稀释后，点眼滴鼻加肌肉注射 21日龄的SPF鸡20只，每只0.2 mL。21 d后，按上述途径重复接种一次。第二次接种后21 d，采集所有鸡血清，按照《中国兽药典》附录3305检测所有相关病毒。

2.8 致病力试验 随机抽取1支冻干培养物，用生理盐水分别稀释至100 EID50/0.2mL和1000 EID50/0.2 mL，每个稀释度分别气管内接种21日龄、35日龄、49日龄 SPF鸡各10只，每只0.2 mL。同时，每个日龄组设生理盐水对照鸡10只。接种后连续观察14 d，记录死亡数和出现精神沉郁、张口呼吸、结膜炎等症状，并于接种后第3天和第5天采集咽拭子，于1 mL TPB溶液静置后，抽提病毒组DNA，用TK基因特异性引物(Forward 5'-3'：TCCGAGTTCGAGAACGATGAC，Reverse 5'-3'：GAGTGGGTGCCTATCTACGAG)进行PCR扩增，检测病毒分离情况。扩增条件和程序如下：95 ℃预变性5 min，进入循环扩增：94 ℃ 40 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30次后72 ℃再延伸10 min。

3 结果与分析

3.1 性状观察 冻干培养物为海绵状团块，较易与瓶壁脱离，加生理盐水振摇1 min内溶解。

3.2 无菌检验与支原体检验 冻干毒种按照《中国兽药典》进行无菌检验和支原体检验，结果均符合规定。

3.3 真空度测定 使用高频火花真空测定器对冻干毒种进行测定，出现白色、粉色或紫色辉光的判为合格。本冻干培养物真空度测定合格率为96%。24个月后随机抽取5支，真空度检验5/5合格。

3.4 病毒含量测定 使用蔗糖牛奶作为保护剂的冻干毒对鸡胚的半数感染量分别为104.9、105.0和104.8EID50/0.2mL，符合要求；使用自配冻干保护剂的冻干毒对鸡胚的半数感染量分别为105.3、105.1和105.1EID50/0.2mL，符合要求，且略优于蔗糖牛奶的保护效果。24个月后，使用蔗糖牛奶作为保护剂的冻干毒对鸡胚的半数感染量分别为104.5、104.5和104.0EID50/0.2mL；使用自配冻干保护剂的冻干毒对鸡胚半数感染量分别为105.0、105.0和105.1EID50/0.2mL，自配保护剂的保护效果较蔗糖牛奶稳定。

3.5 特异性检验 该病毒可被ILT阳性血清完全中和，特异性良好。

3.6 外源病毒检验 血清抗体检测结果表明无以下病毒的污染，具体结果见表1。

表1 外源病毒检验结果Tab 1 Results of adventitious agents detection

3.7 致病力试验 该冻干毒在100 EID50和1000 EID50均可引起不同日龄(21日龄、35日龄和49日龄)SPF鸡发病或死亡，且100 EID50即可引起至少80%的发病率(具体见表2和表3)，接种鸡在接种后第3天，可从咽拭子中检测到病毒核酸(图1)，并出现精神沉郁、张口呼吸、结膜炎等临床症状。自第10天逐渐减轻直至消失，剖检死亡鸡只喉头和气管内可见干酪样分泌物或出血(图2)。

表2 不同日龄鸡只接种不同病毒含量病毒的发病率与死亡率Tab 2 The morbidity and mortality on different-day chickens caused by virus with different viral titers

表3 不同日龄鸡只在不同攻毒剂量下的发病或死亡记录Tab 3 Record of Clinical signs or death of chickens of various age with various challenge

NC：阴性对照; M：DL-2000 分子质量标准; Sample：咽拭子PCR扩增结果NC：Negative control; M：DL-2000 Marker; Sample：PCR products of swab extraction图1 100 EID50攻毒后病毒PCR检测结果Fig 1 Virus isolation by PCR post challange

A：临床可见眼炎 结膜炎；B：气管内干酪样物质；C：喉头黄色干酪样物质；D：气管喉头充血出血A：Ophthalmitis，conjunctivitis；B：Cheesy secretions in trachea；C：Cheesy exudates in larynx；D：Congestion and hemorrhage in respiratory tract图2 临床症状及剖检结果Fig 2 Clinical symptoms and pathological examinations

4 讨 论

本研究所用原始毒株分离于江苏某鸡场病鸡喉头气管，经接种鸡胚绒毛尿囊膜所得[11]。在该毒株的制备繁殖与冻干中，经本试验室摸索探究，将病毒稀释液由生理盐水更换为TPB溶液，可有效提升病毒含量；而将冻干保护剂由蔗糖牛奶换作自配保护剂，也减少了冻干损失，同样有助于病毒含量的稳定。早在1955年，Ginsberg就将TPB溶液应用于Hela细胞的培养中，Watcharee Saisongkorh的研究也表明TPB溶液可有效提升猫立克次体在哺乳细胞系中的复制能力，这些应用多以5%～10%的比例添加于细胞培养液中[12-13]。而在该病毒的鸡胚法扩繁，尤其是前几代的繁育中，直接使用TPB溶液作为接种和收获病毒的稀释液，提升了病毒含量。在其他禽类病毒如传染性法氏囊病病毒的繁殖培育中，TPB溶液的使用也有类似报道[14-16]。

而不同微生物因自身结构、培养方法等差异对保护剂的种类配比要求也不一样。张云浦、王栋、孙中成等人对某些禽类疫苗如新城疫、传染性支气管炎、马立克、鸡痘等耐热冻干保护剂都有过不同的研究报道[17-19]。本试验中采用的保护剂成分与上述报道亦有相似之处，如应用水解明胶可去除杂质蛋白，防止有效活性物质随水蒸气升华分散，保证骨架支撑，促成更好的成品状态；一定比例的蔗糖可降低渗透压差，防止结晶，也能更好维持抗原性；水解乳蛋白和酪蛋白酶促水解物富含丰富氨基酸，保护或提供所需营养物质；谷氨酸盐作为表面活性剂，降低冻结和脱水过程中张力引起的变形，并在复水过程中对活性组分起到润湿作用；此外还有磷酸二氢钾、磷酸氢钠等pH调节剂的加入[20]。从保存期结果可以看出，自配保护剂组与常规5%蔗糖牛奶组对比，同样在-20 ℃以下存放24个月，前者毒价表现明显更稳定，这对于检验用强毒而言十分关键。

在前期试验中，我们采用库存王岗株毒株对35日龄SPF鸡的攻毒试验结果显示，104EID50剂量攻毒组，4/10出现张口呼吸症状，2/10死亡；104.5EID50剂量攻毒组，7/10出现张口呼吸，3/10死亡，且结膜炎表现不是很突出，可见以10000 EID50剂量接种也不能保证75%的发病率。本实验室制备的冻干培养物针对不同日龄的鸡只以100 EID50剂量攻毒即可导致80%的发病率，表现出稳定的致病力。从35日龄鸡只攻毒结果可看出，与库存毒株王岗株相比，更小的接种剂量可引起更高的发病率和致死率，且结膜炎临床表现较为明显，更易于观察。下一步，拟在同样的条件和剂量下，将本冻干物与王岗株一同作为攻毒对照，进行更加直接的比对和记录，并拟建立和制定更为详细的打分规则，使得攻毒对照更为直观：如将呼吸频率分为0(正常呼吸)、1(张口呼吸)、2(伸颈呼吸)；结膜炎分为0(正常)、1(肿胀和眼睑部分闭合)、2(完全闭眼)；精神沉郁分为0(正常行为)、1(轻微沉郁)、2(严重抑郁无精神)；死亡直接记为3分等，同时引入不同时间点体重的测定，以更加立体、全面、细致地评价二者毒株差异[21]。

此外，在病毒分离检测预试验中，我们发现采用棉拭子途径分离检测病毒的敏感性不低于病死鸡喉头组织粘膜匀浆沉淀，甚至比喉头组织上清液敏感性要高，并且PCR检测出病毒阳性的时间与临床上出现症状的时间基本一致：一般是从攻毒后第3天开始出现症状，第5天分离率最高，至10 d以后基本恢复。因此，在实际应用中，建议使用100 EID50剂量进行气管内攻毒，并于攻毒后第3天和第5天采集咽拭子以作效力评价。

本试验制备的鸡传染性喉气管炎病毒流行株冻干毒可有效应用于疫苗评价，为方便获取稳定大量表达，后期拟进行该毒株的细胞适应化研究，以进一步做好评价支持。