胶东地区不同家禽MSSA和MRSA的流行分布与耐药性分析
2023-03-15赵建梅隋明华段笑笑刘俊辉张青青黄秀梅高玉斌王君玮曲志娜刘焕奇
肖 震，刘 娜，赵建梅，李 彦，隋明华，王 娟，段笑笑，韩 云，刘俊辉，王 琳，张青青，黄秀梅，高玉斌，王君玮，曲志娜*，刘焕奇
(1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266032；2. 青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109；3. 青岛市动物疫病预防控制中心，山东 青岛 266041；4. 莱西市农业农村局，山东 青岛 266600)
金黄色葡萄球菌(S.aureus)广泛分布于世界各地，是人类和其他动物多种感染病的主要病原菌，包括轻微的细菌感染甚至到危及生命的菌血症[1-2]。金黄色葡萄球菌的来源报道最早可以追溯到1880年，当时亚历山大·奥斯顿(Alexander Ogston)从手术伤口感染中分离出金黄色葡萄球菌。这种分离的微生物能够在注射到豚鼠和小鼠体内时产生脓肿。[3-4]近年来，随着全球范围内抗生素药物的广泛使用，金黄色葡萄球菌耐药状况日趋严重，以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为典型代表的多重耐药菌株的相关报道渐增。有研究显示，全球不同地区MRSA的感染率占到金黄色葡萄球菌总检出数量的30%～60%，且呈逐年上升趋势[5]。MRSA主要是由mecA编码低亲和力青霉素结合蛋白2a (PBP2a)而产生耐药性[6]，该蛋白对所有β-内酰胺类抗菌素(青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类)具有低亲和力，使葡萄球菌对这一大型和关键的抗菌素类产生耐药性[7-8]；也有一小部分由于质粒介导产生的β2内酰胺酶而产生耐药性。有分析证实家畜接触和人类耐甲氧西林金黄色葡萄球菌传播之间呈正相关，农场人员和职业接触猪或家禽的工人也面临着被家畜相关MRSA (LA-MRSA)感染的高风险。[9-11]因MRSA感染率高，致死率高，对多种抗生素耐药，成为全球性临床治疗难点，不仅严重威胁人类公共卫生安全，而且畜禽携带耐药菌，也会因治疗困难给养殖业生产带来巨大的经济损失。由于动物源细菌耐药性存在时间、空间、动物间等流行分布差异，且MRSA的报道多以牛源、猪源为主，禽源报道较少。因此，本研究通过分析青岛地区不同禽源MSSA和MRSA的流行及耐药情况，采取有针对性的干预措施。本研究旨在评估青岛地区蛋鸡、肉鸡、水禽三种不同家禽共2730份咽拭子样品中MSSA和MRSA的流行情况、耐药特征及spa优势型别，为该地区防控MRSA及临床合理用药提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器 金黄色葡萄球菌显色培养基、MRSA显色培养基购于上海欣中生物工程有限公司；7.5%氯化钠肉汤、胰蛋白胨大豆琼脂，购于北京陆桥技术股份有限公司；基质、裂解液，均购于郑州安图生物工程股份有限公司，Go Taq Green Master Mix、DNA Marker DL1 000购于TaKaRa公司，核酸染料、琼脂糖；96孔药敏板，购于上海星佰生物技术有限公司；生物安全柜；细菌恒温培养箱；MS1000全自动微生物质谱检测系统； PTC200 基因扩增仪；电泳仪、XR凝胶成像分析仪；比浊仪；涡旋混匀仪等。金黄色葡萄球菌ATCC 29213和MRSA ATCC 33591均由中国动物卫生与流行病学中心致病微生物监测室提供。
1.2 样品来源 2021年8月至10月期间，在胶东地区从49个养殖场(蛋鸡场15个、肉鸡场22个、水禽 (肉鸭、鹅) 场12个)采集2730份咽拭子，用于本实验研究。
1.3 金黄色葡萄球菌、MRSA的分离与鉴定 将采集的咽拭子置于预先盛有7.5%氯化钠肉汤的离心管中，37 ℃恒温培养18 h后，三区划线分别接种于金黄色葡萄球菌显色培养基和MRSA显色培养基，37 ℃培养18～24 h，挑取疑似阳性单菌落，再次划线于上述两种显色培养基中，重复操作3次，挑取单菌落接种于胰蛋白胨大豆培养基中，37 ℃培养18～24 h后，挑取单菌落涂布到96孔靶板上，使用MS1000全自动微生物质谱检测系统鉴定。上述步骤同时以质控菌株ATCC 29213做阳性对照。
选取部分金黄色葡萄球菌菌株，煮沸法粗提细菌DNA作为PCR模板，参考文献[12]设计mecA引物，见表1。反应体系：Go Taq Green Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板2 μL，DDH20补足25 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min,30个循环，72 ℃再延伸5 min。扩增产物经1.5%琼脂糖进行凝胶电泳，电泳缓冲液浓度为1×TAE，130V，25 min，凝胶成像仪观察结果。同时以质控菌株ATCC33591作为阳性对照同步进行。
1.4spa分型 选取214株MRSA和137株 MSSA 进行spa分型实验。查阅文献[13]并参照设计引物如表1所示。由擎科生物科技有限公司合成。反应体系设置为Go Taq Green Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，DDH20补足25 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，35个循环；最后72 ℃延伸7 min。扩增后产物送由擎科生物科技有限公司测序。spa基因重复序列区域5’端的标志序列为RCAMCAAAA，3’端的标志序列为TAYATGTCGT。按此规则截取spa基因重复序列区域，并按照24 bp分割成不同的重复单元，结果提交至spa分型数据库(http:∥www.ridom.de/spaserver/)进行分型分析。
表1 引物序列及目的片段大小Tab 1 Primer sequences and target fragment sizes
1.5 药敏试验 选取97株MSSA和102株MRSA，采用美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法，使用96孔药敏板测定13大类18种抗菌药的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration, MIC)，并根据CLSI的判定标准获得实验菌株敏感(S)、中介(I)和耐药(R)的结果。同时使用质控菌株ATCC 29213同步进行，质控菌株在质控范围内，且阳性对照有菌生长、阴性对照无菌生长，则结果判读有效。对3类及3类以上抗菌药同时耐药即为多重耐药。
1.6 数据统计及处理 使用SPSS 26.0软件、卡方检验进行统计及差异显著性分析，P≤0.01，则差异极显著，用“**”表示；0.01
2 结果与分析
2.1 MSSA和MRSA菌株分布情况 2730份咽拭子样品中，共分离到金黄色葡萄球菌742株，总体分离率为27.18%。其中MSSA 528株，MRSA 214株，分离率分别为19.34%和7.84%。从不同家禽看，水禽源菌株总体分离率最高(38.33%)，其次是蛋鸡(28.45%)、肉鸡(20.33%)。无论是MSSA还是MRSA在水禽中分离率均为最高(27.58%、10.76%)且青岛地区蛋鸡、肉鸡、水禽三种不同来源的菌株分离率均有极显著差异。详见表2。
表2 青岛地区不同家禽MSSA和MRSA分离率(菌株数/采样量)Tab 2 MSSA and MRSA isolation rates in different poultry species in Qingdao, China(number of strains / sample size)
2.2spa分型结果 对214株MRSA和137株 MSSA的PCR扩增产物进行凝胶电泳和测序比对，获得16种spa型别，详见表3。对不同禽源分离菌株建立了基于spa型别的最小生成树，展示了肉鸡、蛋鸡及水禽分离菌株的种群结构及菌株间亲缘关系，详见图1～图3。其中，MRSA 有7种spa型，分别为t899(204，95.30%)、t1939(1.87%)、t034(0.93%)、t4558(0.47%)、t1250(0.47%)、t1793(0.47%)、t15591(0.47%)。MSSA有12种spa型，分别为t899、t034、t002、t010、t011、t1793、t2247、t267、t3041、t3155、t5268、t571，其中t899共97株(70.80%)， t034有11株(8.00%)、t010、t2247均有6株(各占4.40%)、t3041、t002、t5268均有3株(各占2.20%)、t1793、t267、t571均有2株(各占1.46%)、t011、t3155均有1株(各占0.73%)。
表3 青岛地区不同家禽来源MSSA和MRSA spa 分型结果Tab 3 Results of MSSA and MRSA spa typing from different poultry sources in Qingdao, China
图1 137株 MSSA与214株MRSA基于不同家禽来源和spa型别的最小生成树Fig 1 Minimum spanning tree of 137 MSSA and 214 MRSA by different poultry and spa type(注： A：所有菌株；B：MSSA；C：MRSA DJ: 蛋鸡 RJ: 肉鸡 SQ:水禽)
图2 青岛地区禽源MSSA与MRSA的耐药率比较Fig 2 Comparison of resistance rates between avian derived MSSA and MRSA in Qingdao, China
从不同家禽看，蛋鸡来源的菌株共得到7种spa型，t899共102株(MSSA 38株，MRSA 64株)，其次是t010共6株，t002共3株，t2247共2株，t034、t3041、t3155各1株，其中，t010、t002、t3155仅在蛋鸡中分布，t034、t3041在蛋鸡，肉鸡，水禽来源的样品中均有分布。蛋鸡来源的MRSA菌株均为t899型别。肉鸡来源的菌株共得到8种spa型，MSSA中， t899共有30株，t034共6株，t2247共4株，t571共2株，t3041、t011各1株。MRSA中，t899共有74株，t1939共4株，t011、t4558各1株。t571、t011仅在肉鸡中分布。水禽来源的菌株共得到8种spa型，MSSA中t899共有29株，t034共有4株，t5268共有3株，t1793、t267各有2株，t3041有1株。MRSA中，t899共有66株，t034共有2株，t1793、t1250、t15591各有1株。其中t1793、t5268、t267仅在水禽中有分布。
2.3 药敏实验结果 根据CLSI的判定标准，97株MSSA及102株MRSA对18种药物的耐药情况见表4。青岛地区分离到的禽源MSSA和MRSA均对18种药物均有不同程度的耐药。97株MSSA对青霉素、红霉素、喹诺酮类药物(恩诺沙星、氧氟沙星)的耐药已十分严重，耐药率均已达到80%以上，对磺胺异噁唑、利奈唑胺、多西环素较为敏感，耐药率均在10%以下。对克林霉素、氟苯尼考、替米考星、庆大霉素均表现中等程度以上的耐药，耐药率在60%～80%之间。对其余药物的耐药率在20%～50%之间。102株MRSA对青霉素、红霉素、克林霉素、喹诺酮类药物(恩诺沙星、氧氟沙星)、氟苯尼考、替米考星等药物耐药严重，耐药率均达到100%，对头孢类、苯唑西林、泰妙菌素、庆大霉素耐药率也在90%以上，对阿莫西林/克拉维酸表现中等程度以上的耐药，耐药率为77.45%。对利奈唑胺、多西环素同样敏感，耐药率均低于5%。对磺胺类药物的耐药率在10%～50%之间。MSSA与MRSA中均未分离到万古霉素耐药菌株。表4和图2显示，除磺胺异噁唑、万古霉素、复方新诺明、多西环素、利奈唑胺5种药物外，MRSA对其余13种药物耐药率均极显著高于MSSA(P<0.01)。
从不同家禽看，蛋鸡、肉鸡、水禽三种家禽来源的MSSA菌株对克林霉素、磺胺异噁唑、替米考星耐药差异极显著(P<0.01)，对红霉素、头孢噻呋、头孢西丁、苯唑西林差异显著(P<0.05)，对其余11种药物无统计学差异。蛋鸡、肉鸡、水禽三种家禽来源的MRSA菌株对阿莫西林/克拉维酸、磺胺异噁唑、泰妙菌素差异极显著(P<0.01)，对庆大霉素差异显著(P<0.05)，对其余药物无统计学差异。
2.4 多重耐药结果 191株金黄色葡萄球菌多重耐药，总体多重耐药率为95.98%(191/199)。其中，97株MSSA中多重耐药株共有89株，占比为91.75%，集中分布在6～8耐，未分离到10耐以上菌株。102株MRSA菌株均为多重耐药株，且均在5耐以上，集中分布在9～10耐。多重耐药结果见图3及表5。
图3 青岛地区三种家禽来源MSSA与MRSA的多重耐药结果Fig 3 Multi drug resistance results of MSSA and MRSA from three poultry sources in Qingdao, China
从不同家禽看，MSSA中，蛋鸡耐药重数较为分散，从0耐到10耐均有分布，其中7耐、8耐占比最多，肉鸡耐药重数分布较为集中，7耐所占比例最多，水禽耐药重数多集中在8耐，其次是6耐，均无10耐及以上菌株。MRSA中，蛋鸡、肉鸡、水禽三种家禽来源的菌株耐药重数均很集中，均有过半比例(64.44%、68.18%、68.25%)为9耐菌株。
表5 青岛地区三种家禽来源MSSA与MRSA的多重耐药结果Tab 4 Multi drug resistance results of MSSA and MRSA from three poultry sources in Qingdao, China
3 讨 论
金黄色葡萄球菌广泛分布于世界各地区、各类动物体内，随着抗菌药的广泛使用导致耐药菌株不断增多，以MRSA为代表的耐药菌株报道较多，尤以猪源、牛源为主，近年来禽源样品也有报道。范丽霞等人针对山东地区畜禽粪污进行了金黄色葡萄球菌的分离鉴定，结果显示80份样品中有3份检出有金黄色葡萄球菌，分离率达到3.75%。[14]低于本研究，推测原因在于粪样样本与咽拭子样本等不同样本形式对最终分离率存在影响，咽拭子分离率较高而粪样较低。王龙光对胶东地区生猪生产链各环节分离鉴定，2556 份样品共分离出 MSSA 386 株(15.10%)，MRSA 122 株(4.77%)，SA 的分离率为19.87%，[15]低于本文禽源样本分离率。陈瑶等对重庆市多个动物源(猪、鸡、牛、羊、兔)进行粪样采集及金黄色葡萄球菌分离鉴定，其中猪源分离率较高，而鸡源金黄色葡萄球菌分离率仅占7.6%[16]。四川省不同地区养禽场(鸡、鸭)MRSA检出率在22.95%[17]。韩国学者Song等在一份报告中指出，奶牛乳腺炎乳样中，MRSA的检出率有逐年上升的趋势，从 1.3%(2003)、2.5%(2007)、4.3%(2011)上涨到13.9%(2012)[18]。在Saliha Bounar-Kechih的一项研究中，从阿尔及利亚北部地区的蛋鸡和肉鸡屠宰场采集了共8375份样品，其中金黄色葡萄球菌在蛋鸡和肉鸡中分离率分别为42%和 12%[19]。本实验所用样品均来源于青岛地区的三种不同家禽，具有广泛代表性。2730份咽拭子样品中，金黄色葡萄球菌、MSSA、MRSA分离率分别为27.18%、19.34%和7.84%。其中，水禽来源的金黄色葡萄球菌的整体分离率及MRSA分离率均显著高于蛋鸡和肉鸡来源菌株。综上所述，不同国家及地区、不同动物甚至不同品种家禽来源的MSSA及MRSA分离率不尽相同，原因可能在于不同国家、不同地区的细菌流行情况、养殖规模化程度以及畜禽饲养管理不同，导致分离率出现差异。
spa分型结果显示，无论是从不同家禽来源来看还是从青岛不同市区来看，t899在MSSA和MRSA菌株中均为优势型别。葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A)是金黄色葡萄球菌细胞壁的组成部分和重要的毒力因子，包括Fc结合区，X区和C末端H区域。X区是由24 bp 重复序列串联而成的可变重复区域[20],基因呈现高度多态性[21],良好的重复性及稳定性，广泛用于金黄色葡萄球菌的分型研究。颜文光等人在研究中发现62株动物源(猪、牛、羊、鸭)金黄色葡萄球菌菌株中共检测到17种基因型，检测到最多的型别为t899(30.65%)[22]。何文强等人对青岛省相关鸡肉产品调查后发现，主要的 MRSA 克隆是 ST9-t899 SCCmecIVb/PFGE A (70.0%, 14/20)。在 MSSA 分离株中，ST9-t899/PFGE A 最为普遍(27.6%)，均与本文结果相近[23]，说明青岛地区家禽源金黄色葡萄球菌也是以t899型别为主的克隆传播。但应注意，部分型别仅在蛋鸡(t010、t002、t3155)或肉鸡(t571、t011)或水禽(t1793、t5268、t267)中分离到。
药敏结果显示， MSSA对多种药物显示出高水平耐药， MSRA更甚。二者对青霉素、红霉素、喹诺酮类药物(恩诺沙星、氧氟沙星)耐药率均已超过80%。三种家禽来源中，肉鸡来源的菌株对克林霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、替米考星的敏感性低于其余两种来源，蛋鸡来源的菌株对泰妙菌素、庆大霉素的敏感性低于其余两种来源，水禽对头孢类药物(头孢噻呋、头孢西丁)、苯唑西林的敏感性低于其余两种来源，因此，在临床用药的选择上，对不同家禽应注意规避上述对应低敏性药物的使用。国内有研究报道显示，鸡源金黄色葡萄球菌对大多数抗生素具有耐药性，其中对青霉素、红霉素耐药率较高，甚至接近于 100%[24]。本文结果显示，实验菌株对利奈唑胺、多西环素耐药率较低，低于10%，且未发现万古霉素耐药菌株。此结果与李淑敏[25]Nelisiwe Mkize[26]等人的研究结果相近。颜敏等采集了病鸭的关节渗出液、肝脏、脾脏组织，使用纸片扩散法对分离的金黄色葡萄球菌进行药敏实验，结果显示分离株对青霉素、链霉素、环丙沙星、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素高度耐药；对庆大霉素、四环素、卡那霉素、新霉素中度耐药，对阿莫西林、氟苯尼考、强力霉素、红霉素、阿米卡星较为敏感，对米诺环素、头孢拉定、头孢噻肟高度敏感[27]，与本文结果略有差异。究其原因，可能由于不同养殖场具体用药情况差异所致。因此，临床使用抗生素药物时应减少青霉素、大环内酯类、喹诺酮类、克林霉素等低敏性药物的使用频率。
本文研究结果显示，金黄色葡萄球菌多重耐药情况严重。MSSA和MRSA多重耐药率分别高达91.75%、100%，耐药重数集中分布在6～8耐、9～10耐。林杰等的研究中显示，鸡源心肝脾组织分离到的金黄色葡萄球菌的绝大多数(73.9%)同时对5种以上抗生素耐药，表现显著的多重耐药现象[28]，结果与本文相似。刘茜从安徽皖中地区采集的病禽肝脏组织中分离金黄色葡萄球菌并采用 K-B 法进行药敏试验，结果显示，耐药重数以5耐、6耐居多[29]，耐药重数略低于本文。值得注意的是，本文中MSSA和MRSA菌株均对多西环素的中介率较高，分别达到19.59%和82.35%，暗示二者对其的耐药率在未来有上升的可能性。总的来说，国内外各研究中MSSA与MRSA耐药及多重耐药结果虽有出入，但均显示二者对多种抗菌药的耐药情况严峻，多重耐药菌株耐药性上升，未来防控更加艰难，给养殖业的发展及公共卫生问题带来巨大阻碍。
金黄色葡萄球菌在青岛地区不同家禽中均有不同程度的分布，且分离菌株耐药现象较为普遍，其中MRSA耐药尤为严重，存在耐药菌株传播给人的风险，对人类健康具有安全隐患。耐药菌株虽然呈现“型多面广”的现象，但主要是以t899型别为主的克隆传播，因此应通过分子溯源技术深入了解各地区中金黄色葡萄球菌的流行趋势，结合耐药表型监测，规范兽用抗菌药的使用，为MSSA和MRSA的有效防控提供依据。
4 结 论
金黄色葡萄球菌(MSSA、MRSA)在青岛地区家禽中分布较为广泛，且在不同家禽中的携带情况存在差异，水禽携带MSSA和MRSA的现象较其它两种家禽更为普遍；MSSA和MRSA均是以t899为主的克隆传播；青岛禽源金黄色葡萄球菌对多种抗菌药普遍耐药，且MRSA较MSSA耐药更为严重，均为多重耐药菌株。综上所述，应加强家禽养殖过程中耐药菌株的流行病学调查与分析，规范兽用抗菌药的合理使用与监管，以有效遏制耐药菌株的产生与传播。
