基于网络药理学探讨清心滋肾汤治疗围绝经期综合征的作用机制

郭倩, 张秦, 管群

围绝经期综合征（MPS）是指妇女在绝经前后出现以自主神经系统功能紊乱为主、伴有低雌激素症状的一组证候群[1］。中医学将本病归属于“绝经前后诸证”“经断前后诸证”等范畴。国医大师夏桂成教授提出本病的病因病机以肾阴虚为本、心肝火旺为标, 主张以清心滋（肝）肾、燮理阴阳为治疗大法[2］, 故创立名方清心滋肾汤。清心滋肾汤问世至今, 几经化裁, 治疗MPS验效颇丰[3］。方中钩藤清心除烦、平肝安神, 莲子心清心除烦安神, 黄连有清热泻火、燥湿解毒之效, 淮山药有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精之功, 山茱萸能滋补肝肾、止汗, 太子参有益气健脾、生津润肺之效, 茯苓有健脾宁心、利水渗湿之能, 熟地能滋阴养血、益精充髓。诸药合用, 使得心肾相交、水火既济、脏腑平秘。但尚未有关于其药理作用的研究, 对于清心滋肾汤治疗MPS的有效成分、作用靶点和机制仍不是十分明确。

网络药理学是运用数据库检索、计算机模拟以及数据分析等方法, 构建药物成分-靶点-疾病的调控网络, 为中医药治疗疾病提供理论支撑[4］。本研究于2021年1—6月运用网络药理学探讨清心滋肾汤治疗MPS的作用机制, 以及可能的信号通路, 以期为临床实践提供理论依据以及动物实验提供方向。

1 资料与方法

1.1 清心滋肾汤药物活性成分及靶点的收集和筛选通过检索TCMSP数据库, 以口服生物利用度（OB）≥30%、药物相似性（DL）≥0.18作为筛选条件, 对清心滋肾汤中8味中药（钩藤、莲子心、黄连、淮山药、山茱萸、太子参、茯苓、熟地）的活性成分和靶点进行检索。再将活性成分对应的靶点基因导入蛋白质数据库Uniprot, 限定物种为人（Homo sapiens）, 并对每个靶点对应的基因进行校正, 从而获得标准化的名称Gene Symbol, 简称Symbol。

1.2 MPS疾病靶点的预测将“Perimenopausal syndrome”和“Climacteric syndrome”作为检索词, 通过检索基因名片数据库GeneCards、人类孟德尔遗传数据库OMIM、治疗靶点数据库TTD、药物基因组学知识库PharmGkb、DrugBank等疾病相关数据库, 去除重复的靶点后取并集, 获得疾病靶点基因。

1.3 清心滋肾汤对MPS作用靶点的预测运用Venn R对MPS疾病基因与清心滋肾汤药物共同靶点进行对比分析, 将MPS与中药活性成分对应的靶点基因取交集, 将交集靶点作为构建中药复方调控网络的桥梁。

1.4 构建清心滋肾汤“活性成分-靶点”中药复方调控网络将药物活性成分、MPS靶点基因、交集靶点基因导入Cytoscape 3.8.0中, 构建清心滋肾汤“活性成分-靶点”复方调控网络。

1.5 构建交集基因蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络运用String数据库进行PPI分析, 导入中药活性成分对应的靶点基因与疾病靶点基因的交集, 设置蛋白种类为“Homo sapiens”, 设置相互作用阈值为“medium confidence”（0.4）, 去除游离节点, 建立PPI网络。

1.6 基因本体论（GO）与京都基因和基因组数据库（KEGG）富集分析将基因Symbol转化为基因ID, 通过R软件进行GO和KEGG通路富集分析, 绘制气泡图及相关信号通路图。

2 结果

2.1 筛选清心滋肾汤有效活性成分通过TCMSP数据库检索出清心滋肾汤中包含的药物, 经OB、DL值筛选出可被口服吸收的119个活性成分, 删除无作用及重复靶点, 获得93个有效活性成分, 如表1。

表1 清心滋肾汤中药活性成分

2.2 筛选MPS疾病基因以“Perimenopausal syndrome”和“Climacteric syndrome”为检索词在 Gene-Cards、OMIM、TTD、PharmGkb、DrugBank数据库中进行查找, 最终在GeneCards、PharmGkb、DrugBank检索到相应内容, 将3个数据库检索到的基因取并集、去重复, 共得到451个MPS的基因靶点。

2.3 “药物靶点-疾病基因”交集作用靶点的预测运用R x64 4.1.1对清心滋肾汤中有效活性成分对应的基因靶点和MPS疾病靶点进行Venn分析, 获得 54个显效靶点基因交集, 主要有SCN5A、雌激素受体-1（ESR1）、OPRM1、AR、ADRA1B、ADRA1D、MAPK1、CDKN1A、血红素加氧酶1（HMOX1）、孕激素受体（PGR）、CYP3A4等靶点。

2.4 构建“活性成分-靶点基因”调控网络基于Cytoscape构建清心滋肾汤各药物活性成分与MPS疾病靶点的网络图, 如图1。其中度值（Degree）越高, 表示其在调控网络中的作用越强。图1是由54个潜在靶点基因和69个活性成分组成的调控网络。由于每个潜在的靶点基因都与多个活性成分之间存在联系, 可以推测清心滋肾汤治疗MPS可能是多靶点、多途径的。

图1 清心滋肾汤治疗围绝经期综合征“药物-成分-靶点-疾病”可视化网络图

2.5 清心滋肾汤与MPS交集基因PPI网络的构建将“2.3”中得到的54个交集基因导入String数据库, 设置物种为Homo sapiens, medium confidence设置为0.400, 去除游离节点, 构建PPI网络图, 如图2。该图由54个节点（Node）、350条边（Edge）构成, 平均节点度值为13。

图2 清心滋肾汤治疗围绝经期综合征交集靶点的蛋白互作网络（PPI）图

将构建的PPI网络图以tsv的形式导入Cytoscape 3.8.0, 运用CytoNCA对节点进行BC（betweenness centralities）、CC（closeness centralities）、DC（degree centralities）、EC（eigenvector centralities）、LAC（local average connectivity-based centralities）、NC（network centralities）数值再计算一次, 选取数值大于中位值的节点构建PPI核心, 该核心由12个节点、74条边构成, 根据度值由大到小依次为：白细胞介素（IL）-6（度值80）、IL-1β（度值64）、ESR1（度值54）、人纤溶酶原激活物抑制剂1（SERPINE1）（度值52）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）（度值52）、补体调节蛋白（CRP）（度值42）、细胞周期蛋白D1（CCND1）（度值40）、PGR（度值38）、HMOX1（度值38）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）（度值36）、胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）（度值32）、细胞色素P450芳香化酶（CYP19A1）（度值30）, 以上

基因被认为是治疗MPS的核心靶点。

续表1 清心滋肾汤中药活性成分

2.6 GO富集分析运用R软件将基因Symbol转换为基因ID。对“2.5”中获得的核心靶点基因进行 GO 富集分析, 共获得P＜0.05的GO功能条目1 280条, 其中生物过程（BP）1 180条, 细胞组分（CC）39条, 分子功能（MF）61条。其中生物过程、细胞组分、分子功能富集基因数排序前31位的GO分析结果绘制气泡图, 如图3。生物过程主要富集在对药物的反应、多细胞生物过程、对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应等生物反应。细胞组分主要富集在细胞膜筏、细胞膜微结构域、细胞膜小窝、血浆细胞膜筏等细胞部位。分子功能主要富集在核受体活动、配体激活、转录因子活动、G蛋白偶联受体活性等。如图3所示, 可以推测清心滋肾汤是通过调节多个GO功能来发挥治疗作用的。

图3 清心滋肾汤治疗围绝经期综合征GO富集气泡图

2.7 KEGG通路富集分析通过KEGG通路富集分析共获得162条信号通路, 找到与MPS相关信号通路Estrogen signaling pathway（雌激素信号通路）绘制通路图, 如图4。筛选出前30条信号通路, 绘制气泡图, 如图5。根据气泡图可以看出主要涉及的信号通路有糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、化学致癌作用受体激活通路、脂质和动脉粥样硬化信号通路、PI3K-Akt信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化通路、乳腺癌通路、细胞衰老通路等。由此可见, 清心滋肾汤通过协同作用于多条信号通路来治疗MPS。选取相关性最大的AGE-RAGE信号通路绘制通路图, 如图6。

图4 清心滋肾汤Estrogen signaling pathway（雌激素信号通路）潜在靶基因KEGG分析图

图5 清心滋肾汤治疗围绝经期综合征KEGG信号通路气泡图

图6 清心滋肾汤AGE-RAGE信号通路潜在靶基因KEGG分析图

3 讨论

由图1可以发现, 清心滋肾汤中起作用的主要活性成分共69个, 其中度值较高的活性成分有木樨草素、槲皮素、豆甾醇、谷固醇、山柰酚、四氢鸭脚木碱等, 提示这些活性成分在改善围绝经期症状中发挥重要作用, 推测其可能是清心滋肾汤治疗MPS的有效成分。木樨草素是天然黄酮类化合物中的代表性成分, 具有抗炎、抗氧化、降血压和舒张血管、抗动脉硬化等药理学作用[5］。山柰酚亦为黄酮类化合物, 研究显示, 山柰酚和木樨草素具有抗脂代谢紊乱和抗细胞凋亡的功效, 从而起到保护缺血心肌的作用[6］。此外, 山柰酚可通过上调骨骼肌P13KAKT-GLUT4信号通路, 改善糖尿病小鼠胰岛素抵抗[7］。由此可见, 山柰酚和木樨草素可以改善围绝经期女性糖脂代谢紊乱的状态, 降低心血管病的发生风险。槲皮素具有抗炎、抗氧化、降糖、降脂、促进颗粒细胞增殖改善卵巢功能等作用[8］, 即通过改善卵巢功能, 提高雌激素水平从而降低MPS远期并发症发生的风险。豆甾醇和谷固醇分别作为植物甾醇和植物固醇, 具有抗炎、抗氧化、抗癌、降胆固醇、调节体内激素和调节代谢的作用[9-10］。四氢鸭脚木碱是从鸡骨常山中提取的生物碱类化合物, 具有抗高血压、抗糖尿病、抗菌等作用[11］。故清心滋肾汤有效成分对高血压、糖尿病、高脂血症、动脉粥样硬化、氧化应激等围绝经期易出现的疾病均具有一定的干预作用。

通 过 构 建PPI核 心 得 到IL-6、IL-1β、ESR1、PPARG、PGR、CYP19A1等12个与MPS关系较为密切的靶点基因。围绝经期病人由于雌激素水平明显下降, 雌激素受体亦随之下降, 导致免疫细胞不能产生足够量的IL-6、IL-1β等免疫介质, 与去甲肾上腺素的比例失调, 最终导致MPS临床症状的发生[12］。ESR1表达水平和雌激素的生物学效应相关, ESR1基因中XbaI位和PvuI位多态性与早发性卵巢功能不全（POI）的发生存在相关性[13］。研究发现PGR信号传导是卵母细胞排卵所必须的, PGR缺失小鼠无法排卵[14］。PPARG基因在调节胰岛素敏感性、脂肪细胞特异基因表达方面有突出的作用, 可能与糖尿病、代谢综合征的发生密切相关[15］。绝经后使用芳香化酶抑制剂的乳腺癌病人的血脂水平与CYP19A1的单核苷酸多态性有关[16］。此外, 本研究 中 还 发 现CCND1、CRP、SERPINE1、HMOX1、VCAM-1、IGFBP3等基因也与MPS密切相关。

基于KEGG通路富集分析可以看出清心滋肾汤治疗MPS的潜在信号通路包括糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化信号通路、PI3K-Akt信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化通路等。研究显示AGE-RAGE系统在炎症反应、细胞损伤等方面均有促进作用, 参与心血管疾病、代谢综合征、2型糖尿病、卵巢功能障碍等多种疾病的发生[17］。前期研究已经证实清心滋肾汤能在一定程度上调节绝经综合征所引起的脂质紊乱状态, 主要通过调节脂质代谢发挥作用[18］, 推测与脂质和动脉粥样硬化信号通路有关。研究发现雌激素能增加一氧化氮（NO）的释放, 降低内皮素的产生, 而流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路可通过调控NO的释放, 影响内皮细胞的功能及血管通透性的改变, 促进脂质蓄积[19］, 故围绝经期女性由于卵巢功能的衰退, 雌激素水平下降, 易出现高血压、代谢性疾病等。随着生活质量的提高, 对于围绝经期妇女心血管疾病的预防和治疗引起了广泛关注。PI3K-Akt信号通路是调控细胞生存、生长和增殖的经典通路, 王君实等[20］研究发现亚麻木酚素的主要活性成分SDG可通过增加血清雌二醇水平激活ESR1, 从而激活PI3K-Akt-eNOS信号通路, 对去卵巢大鼠的心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。

综上所述, 清心滋肾汤治疗MPS可能是通过木樨草素、槲皮素、豆甾醇、谷固醇、山柰酚、四氢鸭脚木碱等有效成分作用于IL-6、IL-1β、ESR1、SERPINE1、PPARG、CRP、CCND1、PGR、HMOX1、VCAM-1、CYP19A1、IGFBP3等关键靶点通过调节糖脂代谢、抗氧化、改善雌激素代谢等作用机制达到治疗MPS的作用。