石榴皮止泻散体外抑菌效果研究

伊鹏霏，缪雨臻，兰新财，夏 方，安丽娜，赵丽丽*

(1.吉林大学 动物医学学院，长春 130062；2.浙江金大康动物保健品有限公司，浙江金华 321016；3.石家庄藏诺药业股份有限公司，石家庄 050021)

石榴皮止泻散是由石榴皮饮片和滑石经加工制成的散剂，具有涩肠止泻之功效，主治仔猪白痢。仔猪白痢(White Scour of Piglets)是由致病性大肠杆菌引起的10～30日龄仔猪非败血性、急性肠道传染病。临床表现为拉乳白色或灰白色稀粪，且粪便浆糊状，腥臭黏腻。病猪严重脱水，可视黏膜苍白[1]。该病流行广，传播快，发病率可达80%，且有明显上升的趋势。如不及时治疗或治疗不当，轻者影响仔猪生长发育，重者造成僵猪，给养猪业造成巨大经济损失。

石榴皮的清热、解毒、健胃、润肺、涩肠、止血等功效，得到历代医学家的肯定，中国药典与中国兽药典历版均有收载。石榴皮主含鞣酸类，有收敛杀菌效果，能够涩肠止血，加之其具有良好的抑菌作用，可治疗痢疾、腹泻、便血等病症，将石榴皮用水煎煮或粉碎后直接拌料，治疗效果明显。其配伍具有吸附细菌与毒素作用的滑石，组成复方制剂，可增强疗效，发挥更强的治疗效果。在《中国兽药典(2015年版)》二部中就收载了多个配伍滑石的止泻止痢复方制剂，如止痢散、鸡痢灵片、鸡痢灵散等，均配伍了10%～50%不等的滑石药材。

本研究旨在观察石榴皮止泻散对猪大肠杆菌的抑制作用，并测定其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，为临床进一步研究其对仔猪白痢的治疗效果提供基础。

1 材 料

1.1 菌株 大肠杆菌ATCC25922，购自中国药品生物制品鉴定所；猪源产肠毒素大肠杆菌CVCC 196，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 试验药品 石榴皮止泻散，由浙江金大康动物保健品有限公司生产，包装规格为：800 g/袋；批号为：20170303；用法：口服。

1.3 试剂 MH肉汤培养基、普通肉汤培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司，琼脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物购自英国迪尔拜生物公司，氯化钠购自北京化工厂。

1.4 主要仪器 恒温培养振荡器，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；TGL-16B型高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；精密电子天平，BSA224S，赛多利斯科学仪器(北京)有限责任公司；pH计，FiveEasy，梅特勒托利多。

2 方 法

2.1 石榴皮止泻散水煎液的制备 将石榴皮止泻散用纱布包裹置于锅内，加入约8倍量纯净水，浸泡30 min后，武火加热至沸，文火煎煮30 min，澄出药液。再加入约6倍量纯净水，同法煎煮后澄出药液，将两次药液合并后过滤，用旋转蒸发器60 ℃浓缩至每1 mL药液相当于1 g生药的浓度，并用0.1 M/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.2～7.4，121 ℃高压灭菌15 min，于4 ℃冰箱暂存，使用前水浴加热至37 ℃。

2.2 平板法抑菌试验

2.2.1 菌液制备及细菌浓度调整 将大肠杆菌ATCC25922和猪源产肠毒素大肠杆菌CVCC 196分别接种于LB液体培养基，37 ℃过夜培养。倒板法细菌计数：取适量菌液，稀释107、108或109倍，取1 mL稀释液分别加入培养皿中，然后向平皿倒入适量冷却至45 ℃左右的琼脂培养基，混匀，凝固后转入37 ℃培养箱，培养48 h，计数单菌落个数，每个浓度重复6个平板。调整细菌浓度为108cfu/mL。

2.2.2 抑菌试验 无菌条件下，分别取100 μL 2种供试菌液，均匀涂布于MH肉汤固体培养基表面，待培养基表面晾干后，用灭菌的打孔器在培养基上打直径为6 mm的圆孔，将石榴皮止泻散水煎液滴满孔，重复3孔，另设一孔生理盐水对照孔，静置15 min后平稳的转入37 ℃培养16 h，取出平板观察是否有抑菌圈，并用直尺测量抑菌圈直径。

2.3 MIC和MBC的测定

2.3.1 大肠杆菌肉眼可见浓度的判定 药物对细菌MIC的测定通常是通过肉眼观察菌液是否变浑浊，来判断细菌是否有明显的增殖。因较高浓度的中药有颜色干扰，不能单凭肉眼或借助分光光度计判断是否有细菌增殖，因而先对肉眼可见细菌浓度进行测定。

将大肠杆菌ATCC25922接种于LB液体培养基，37 ℃培养12 h，细菌计数后，用新鲜MH肉汤培养基调整细菌浓度为4×107cfu/mL、2×107cfu/mL、107cfu/mL和5×106cfu/mL，肉眼观察菌液是否浑浊。

2.3.2 菌液制备及细菌浓度调整 将大肠杆菌ATCC25922和猪源产肠毒素大肠杆菌CVCC 196分别接种于LB液体培养基，37 ℃过夜培养。倒板法细菌计数后，用新鲜MH肉汤培养基稀释，调整细菌浓度为106cfu/mL。

2.3.3 测定MIC 将石榴皮止泻散水煎液用MH培养基稀释至400 mg/mL。其余参照文献[1-3]进行，如表1：取9支灭菌试管，编号排列在试管架上，于每管中加入1 mL新鲜的MH培养基，然后向第1支试管中加入1 mL石榴皮止泻散稀释液，混匀后取1 mL加入到第2支试管，依次倍比稀释至第9管，弃去1 mL。然后向各试管中加入1 mL细菌浓度为106cfu/mL的大肠杆菌ATCC25922菌液，混匀，各管的含药浓度依次为100 mg/ml、50 mg /mL、25 mg /mL、12.5 mg /mL、6.25 mg /mL，细菌浓度为5×105cfu/mL。另设1支阳性对照(1 mL MH培养基加1 mL大肠杆菌ATCC25922菌液)和1支阴性对照(2 mL MH培养基)。37 ℃培养16 h。大肠杆菌CVCC 196的检测方法同上。

表1 MIC测定方法Tab 1 MIC determination method

将培养好的菌液进行倒板法细菌计数[2-4]。倒板法细菌计数的方法如下：将各含药菌液于37 ℃培养16 h后，分别取适量进行倍比稀释，然后分别取1 mL稀释倍数为103、104、105倍的稀释液，加入培养皿中，然后向平皿倒入适量冷却至45 ℃左右的琼脂培养基，混匀，凝固后转入37 ℃培养箱，培养48 h，计数单菌落个数。

2.3.4 测定MBC 取高于MIC的所有试管中的液体适量，稀释10倍后，取1 mL加入培养皿中，然后向平皿倒入适量冷却至45 ℃左右的琼脂培养基，混匀，凝固后转入37 ℃培养箱，培养48 h，计数单菌落个数。菌落数低于5个且含药液最少的药液浓度即为MBC[4]。

3 结果与分析

3.1 平板法抑菌试验 石榴皮止泻散水煎液孔周围均有明显的抑菌圈出现(图1)，抑菌圈直径详见表2；生理盐水对照孔周围没有抑菌圈。石榴皮止泻散水煎液有明显的抑制大肠杆菌的效果。

A：石榴皮止泻散水煎液对大肠杆菌ATCC25922的抑菌圈B：石榴皮止泻散水煎液对大肠杆菌CVCC 196的抑菌圈A:Bacteriostatic circle of pomegranate peel Decoction for Relieving diarrhea and dispersive water against Escherichia coli ATCC25922B:Bacteriostatic circle of pomegranate peel Decoction for Relieving diarrhea and dispersive water against Escherichia coli CVCC 196图1 石榴皮止泻散水煎液体外抑制大肠杆菌生长Fig 1 pomegranate peel antidiarrheal powder Decoction inhibits the growth of Escherichia coli in vitro

表2 石榴皮止泻散水煎液体外抑制大肠杆菌生长试验结果(n=3)Tab 2 Experimental results of pomegranate peel antidiarrheal powder Decoction inhibiting the growth of Escherichia coli in vitro (n=3)

3.2 大肠杆菌肉眼可见浓度的判定 细菌浓度为4×107cfu/mL、2×107cfu/mL和107cfu/mL的菌液呈浑浊状，其中浓度为107cfu/mL的菌液浑浊程度较轻；细菌浓度为5×106cfu/mL的菌液不可见浑浊(表3、图2)。即大肠杆菌肉眼可见浓度为大于或等于107cfu/mL。所以细菌浓度小于107cfu/mL即判为无大量细菌生长。

表3 肉眼可见细菌浓度判定Tab 3 Determination of visible bacterial concentration

1：阴性对照；2：细菌浓度为4×107cfu/mL的菌液；3：细菌浓度为2×107cfu/mL的菌液；4：细菌浓度为107cfu/mL的菌液；5：细菌浓度为5×106cfu/mL的菌液。1: Negative control;2: The concentration of bacteria was 4×107cfu/mL bacterial solution;3: The concentration of bacteria was 2×107cfu/mL bacterialsolution;4: The concentration of bacteria was 107cfu/mL bacterial solution;5: The concentration of bacteria was 5×106cfu/mL bacterial solution.图2 肉眼可见细菌浓度判定Fig 2 Determination of bacteria concentration visible to the naked eye

3.3 石榴皮止泻散水煎液对大肠杆菌MIC的测定 药物浓度为100 mg/mL、50 mg/mL的培养液(第1、2支试管)对应的细菌计数的各个平板上均没有细菌生长，即该培养液的细菌浓度为0；药物浓度为25 mg/mL的培养液(第3支试管)对应的部分平板可见单菌落生长，选择其中较为适合计数的一组平板进行单菌落计数，可得该培养液的细菌浓度均低于107cfu/mL；药物浓度为12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.562 mg/mL、0.781 mg/mL和0.390 mg/mL的培养液(第4、5、6、7、8、9支试管)对应的各个平板上均形成菌苔，不适合计数，可得该培养液的细菌浓度远大于107cfu/mL。详细数据及相对应的培养液的细菌浓度见表4、表5。

表4 各含药培养液的细菌浓度Tab 4 bacterial concentration of each medicated culture medium

表5 含25 mg/mL石榴皮止泻散培养液的细菌浓度Tab 5 bacterial concentration of culture solution containing 25 mg/mL pomegranate peel Zhixie powder

即药物浓度为25 mg/mL、50 mg/mL和100 mg/mL时，培养液的细菌浓度低于107cfu/mL，无大量细菌生长。故石榴皮止泻散水煎液对两株大肠杆菌的最小抑菌浓度均为25 mg/mL。

3.4 石榴皮止泻散水煎液对大肠杆菌MBC的测定 高于MIC的所有培养液对应的平板上均无细菌生长，所以石榴皮止泻散水煎液对大肠杆菌的MBC为50 mg/mL。

4 讨论与结论

石榴皮是一味具有悠久应用历史的中兽药，为石榴科植物石榴PunicagranatumL. 的干燥果皮，中国兽药典记载[5]，味酸、涩，性温，归大肠经，具有涩肠止泻、止血，驱虫等功效。用于久泻，久痢，便血，脱肛，带下，虫积腹痛。而仔猪白痢临床表现为拉乳白色或灰白色稀粪，且粪便浆糊状，腥臭黏腻。临床选用石榴皮止泻散进行治疗，能有效缓解仔猪白痢的症状。而造成仔猪白痢的病原是大肠杆菌，众多研究报告表明，中药石榴皮对多种细菌、真菌有抑制或杀灭作用，石榴皮的水提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、黑曲霉、绿脓杆菌、白色念珠菌等有显著抑制作用，其抑菌的主要成分可能为多酚类物质和生物碱[6-9]。

陈雪珊等通过一系列的抑菌试验来验证石榴皮的抑菌效果，石榴皮提取液、浓缩液、冷干粉末及软膏对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌圈直径分别在23.5～11.6 mm，最小抑菌浓度在2500～78.1 μg/mL，最小杀菌浓度在5000～156.3 μg/mL[7]，表明石榴皮的提取液、浓缩液、冷干粉末及软膏均具有较好的体外抗菌活性，幽门螺杆菌甲硝唑耐药株及敏感株都对其敏感[10]，对鲍曼不动杆菌也有较好的抑制作用[11]。熊素英等用石榴皮醇提液进行试验，证明其具有广谱抗菌作用，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为3.125%，对枯草芽抱杆菌和蜡状芽抱杆菌为6.25%，对大肠杆菌为12.5%，对青霉和黑曲霉分别为12.5%、25%，对啤酒酵母和面包酵母为50%[12]。董周永等研究认为，石榴果皮提取物的抑菌机理是其抑制了菌体的己糖磷酸途径(HMP)引起代谢功能障碍，使调控菌体生长、分裂相关蛋白的合成受到抑制，引起细胞质固缩，最终使菌体的生长繁殖受到抑制，甚至死亡[13]。

滑石为硅酸盐类矿物滑石族滑石，主含含水硅酸镁[Mg3(Si4O10)(OH)2]。滑石粉具有保护皮肤和粘膜的作用，能吸附大量化学刺激性物或毒物，因此当撒布于发炎或破损组织的表面时，可有保护的作用；内服时除保护发炎的胃肠粘膜而发挥镇吐、止泻作用外，还能阻止毒物在胃肠中的吸收。滑石粉还有抗菌作用，用平板法使培养基含10%的滑石粉，对伤寒杆菌与副伤寒甲杆菌有抑制作用；用纸片法则仅对脑膜炎球菌有轻度抑菌作用。

本研究对由石榴皮和滑石制成的石榴皮止泻散水煎液进行抑菌试验结果也表明，含药浓度为1 g/mL的石榴皮止泻散水煎液对大肠杆菌有明显的抑制作用，对大肠杆菌的MIC为25 mg/mL，MBC为50 mg/mL。

每1 mL含1 g生药的石榴皮止泻散水煎液在体外对大肠杆菌(大肠杆菌ATCC25922，大肠杆菌CVCC 196)具有抑制作用，MIC为25 mg/mL，MBC为50 mg/mL。