清肺颗粒质量标准的研究

薛沾枚，张 艳，刘雪松，张 备，郝敬友，苏 景，张国华，唐 伟，刘彦凯，孙洪杰，王 岩，史同瑞*

(1.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161005；2.黑龙江省兽用药物重点实验室，黑龙江齐齐哈尔 161005；3.黑龙江省动物疫病控制中心，哈尔滨 150069；4.哈尔滨绿达生动物药业有限公司，哈尔滨 150039)

清肺颗粒收载于《中国兽药典》2020版第二部，清肺颗粒中含有5味中药，分别是板蓝根、南葶苈子、贝母、桔梗、甘草，具有清肺止咳与化痰平喘的功效[1]。主要用于治疗畜禽呼吸道疾病。板蓝根清热解毒，凉血利咽；南葶苈子是播娘篙成熟种子经干燥后而成的，泻肺平喘，利水消肿；贝母清热润肺、化痰止咳、平喘镇痛；桔梗能够起到开宣肺气、利咽祛痰、益气排脓的作用；甘草有调节诸药、止咳润肺、解毒抗炎的功效[2-6]。目前药典中记载清肺颗粒质量标准相对滞后，仅有贝母、桔梗、甘草的薄层色谱鉴别，缺少板蓝根、葶苈子的定性鉴别和对主要药效含量测定，很难对市场上的清肺颗粒的质量进行全面评价[7]。

为进一步研究清肺颗粒的质量标准，本研究采用TLC法对清肺颗粒中中药成分进行鉴别，采用HPLC法对清肺颗粒中主要药理活性成分，槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷进行定量测定[8-9]。本试验从成分鉴别与含量测定两方面研究了清肺颗粒的质量标准，为能够在临床应用中最大化发挥药效，保证制剂的安全性和有效性，减轻和治疗畜禽呼吸道疾病，提高畜禽产品的安全性及质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 仪器 薄层电动点样器(SP-II)、全自动展开仪(TK-20E)、双喷头超细电动喷雾器(TS-II)，购自上海科哲生化科技有限公司；高效液相色谱仪(LC-20AT，RF-20A)、InertSustain C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)购自岛津(中国)有限公司；紫外分析仪(ZF-1，邦西仪器科技有限公司)。

1.2 材料 清肺颗粒剂(批号分别为20200606，20200407，20200408由哈尔滨绿达生动物药业有限公司研制)；硅胶G、GF薄层板(青岛海洋化工厂分厂)；乙腈与甲醇(色谱级，美国北京迪科马科技有限公司)；甲酸(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；石油醚(分析纯、北京迪科马科技有限公司)；乙酸乙酯(分析纯、北京迪科马科技有限公司)；水为超纯水；槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷(批号：111854-201905，含量99.9%)与(R, S)-告依春对照品(批号111753-20207，含量100.0%)，均购于中国食品药品检定研究院；板蓝根、贝母、桔梗、甘草中药对照药材均购于江苏省永健康医疗科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 板蓝根薄层色谱鉴别 供试品溶液制备：取清肺颗粒15 g，加50 mL水溶解，加2次二氯甲烷，振摇，提取，每次50 mL，合并提取液，浓缩至1 mL，备用[10]。

对照品制备：取适量(R, S)-告依春对照品加入甲醇充分溶解，制成每1 mL含0.5 mg的溶液。

对照药材溶液的制备：取板蓝根对照药材15 g，制备方法同供试品。

阴性对照溶液制备：取未加板蓝根的样品颗粒剂15 g，制备方法同供试品。

测定方法：吸取上述溶液各1 μL分别点与同一硅胶G薄层板上，展开剂为石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(1∶1)，待展开后，取出，晾干，在紫外光灯(254 nm)下观察。供试品色谱在与对照药材色谱相应位置上，出现相同颜色的斑点，阴性无干扰，结果见图1。

图1 清肺颗粒中板蓝根TLC图1 (R,S)-告依春对照标准品2板蓝根对照药材3-5三批清肺颗粒样品6阴性对照样品Fig 1 TLC diagram of Radix et Radix Isatidis in Qingfei Granule1 (R,S)- Gaoyichun reference standard 2Radix isatidis reference medicinal materia3-5Three batches of Qingfei Granule samples 6 Negative control sample

2.1.2 浙贝母薄层色谱鉴别 供试品溶液制备：取清肺颗粒15 g研细，加入浓氨试液2 mL、三氯甲烷20 mL，密封过夜；超声30 min，滤液蒸干，残渣加1 mL三氯甲烷溶解；

对照药材溶液制备：另取15 g浙贝母对照药材，制备方法同上；

阴性对照溶液制备：取未加浙贝母的样品颗粒剂15 g，制备方法同上[11]。测定方法：用毛细管取上述溶液各1 μL，分别点样于硅胶G薄板上(CMC-Na为黏合剂)，展开剂为乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(17∶2∶1)，取出，晾干，均匀喷稀碘化铋钾显色液，至有斑点出现[12]。供试品色谱在与对照药材色谱相应位置上，出现相同颜色的斑点，阴性无干扰，结果见图2。

图2 清肺颗粒中贝母TLC图1 贝母对照药材2-4三批清肺颗粒样品5阴性对照样品Fig 2 TLC diagram of Fritillaria in Qingfei Granules1 Fritillaria reference medicinal material2-4Three batches of Qingfei Granule samples 5 Negative control sample

2.1.3 桔梗薄层色谱鉴别

供试品溶液制备：取研细的清肺颗粒15 g研细，加入9 mL盐酸和90 mL水，加热回流提取1 h，待冷却后，滤过，用30 mL乙酸乙酯提取滤液3次，合并提取液，将无水硫酸钠均匀铺置滤纸上，滤过，蒸干，1 mL甲醇溶解残余物质。

对照药材溶液制备：取15 g桔梗对照药材，制备方法同上。

阴性对照溶液制备：取未加桔梗的样品颗粒剂15 g，制备方法同上。测定方法：用毛细管吸取上述溶液各1 μL，分别点样于同一块硅胶G薄板上，展开剂石油醚-乙酸乙酯(7∶4)展开后，取出，晾干，均匀喷10%硫酸乙醇溶液显色剂，105 ℃条件下加热，至斑点显色清晰[13]。供试品色谱在与对照药材色谱相应位置上，出现相同颜色的斑点，阴性无干扰，结果见图3。

图3 清肺颗粒中桔梗TLC图1 桔梗对照药材2-4三批清肺颗粒样品5阴性对照样品Fig 3 TLC diagram of Radix Platycodi in Qingfei Granules1 Radix platycodi reference medicinal material2-4Three batches of Qingfei Granule samples 5 Negative control sample

2.1.4 甘草薄层色谱鉴别 供试品溶液制备：称取清肺颗粒15 g研细，加入40 mL水，超声30 min，过夜，静置分层。取上清液滤过，加2次20 mL正丁醇，取沉淀，加10 mL水洗涤。取正丁醇层溶液水浴蒸干，加1 mL甲醇溶解[14]。

对照药材溶液制备：取15 g甘草对照药材，制备方法同上。

阴性对照溶液制备：取未加甘草的样品颗粒剂15 g，制备方法同上。

测定方法：毛细管吸取上述溶液各1 μL，点样于同一块硅胶G薄板上，展开剂选择正丁醇-冰醋酸-水(配比4∶1∶2)，待展开后，取出后晾干，均匀喷洒10%硫酸乙醇溶液为显色剂，105 ℃加热至斑点显现清晰[15]。供试品色谱在与对照药材色谱相应位置上，出现相同颜色的斑点，阴性无干扰，结果见图4。

图4 清肺颗粒中甘草TLC图1 甘草对照药材2-4三批清肺颗粒样品5阴性对照样品Fig 4 TLC diagram of Radix et Rhizoma Glycyrrhizae in Qingfei Granule1 Liquorice reference medicinal materia2-4Three batches of Qingfei Granule samples 5 Negative control sample

2.2 清肺颗粒中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷含量测定

2.2.1 溶液的制备 对照品溶液制备：精密称取槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷对照品，加入70%甲醇制成20 μg/mL的标准品溶液[2]。供试品溶液制备：取清肺颗粒15 g研细，用石油醚(60～90 ℃)脱脂，加入50 mL70%甲醇溶液，超声30 min，10 000 r/min离心6 min，留清液，过0.45 μm微孔滤膜，即得[16]。

2.2.2 色谱条件 色谱柱选用InertSustain C18，流动相选择乙腈-0.1%醋酸溶液(11∶89)，流速为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，检测波长为254 nm，进样量为10 μL[17]。

2.2.3 线性范围考察 精密移取70%甲醇定容对照标准品，制成1 mL含对照品2.5 μg、5 μg、10 μg、20 μg、40 μg的溶液，在上述色谱条件下测定峰面积[18]。以槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷对照品浓度为坐标轴(X)，色谱峰面积为坐标轴(y)，绘制标准曲线，得出方程y=999.8x+115(R2=0.9998)，结果表明，槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷含量在1～12.5 μg/mL范围内线性关系良好，见图5和6。

图5 槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷标准曲线Fig 5 Standard curve line of Quercetin 3-O-β-D-glucose-7-O-β-D-gentiobioside

图6 槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷标准品液相色谱图Fig.6 Quercetin 3-O-β-D-glucose-7-O-β-D-gentiobioside Standard liquid chromatogram

2.2.4 精密度实验 精密量取浓度为40 μg/mL的对照标准品溶液，上样量为10 μL，连续上样6次，计算相对标准标准差(RSD)[19]。计算对照品峰面积的RSD(n=6)为0.83%，结果表明，建立测定方法的精密度良好，可以满足测定需求。

2.2.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，在上述色谱条件下，间隔2 h分别进样，共测定12个时间点，测定峰面积，计算RSD值。在24 h内连续进样测定，槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷含量RSD为0.85%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.6 重复性试验 取同一批供试品溶液，连续制备6份，在上述色谱条件下，测定槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷平均含量，计算RSD值[10]。重复测定的槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷平均含量为27.14 mg/L，RSD为0.92%，表明测定方法的重复性良好。

2.2.7 加样回收率试验 精密称取己测知槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷含量的清肺颗粒5 g，共6份，分别精密加入对应含量的槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷对照品，按2.2.1处理方法，2.2.2色谱条件下进行含量测定，计算加样回收率及RSD[20]。加样回收率结果见表1，RSD=0.44%(n=6)，平均回收率为98.6%符合要求，表明方法的准确性良好。

表1 槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷加样回收率试验结果Tab 1 Sample recovery test result of Quercetin 3-O-β-D-glucose-7-O-β-D-gentiobioside

2.2.8含量测定 经测定6批清肺颗粒中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷的平均含量见表2，方法按2.2.1项下操作进行含量测定HPLC分析，实验结果说明不同批号的清肺颗粒中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷的含量稳定。

表2 槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷含量测定Tab 2 Content determination of Quercetin 3-O-β-D-glucose-7-O-β-D-gentiobiosid

3 讨论与结论

清肺颗粒当前在临床中具有应用广泛，多用于治疗哮喘、腹腔积水、肺水肿和由心脏疾患引起的心力衰竭等，且疗效显著。《中国兽药典》2020版收载的清肺颗粒，仅对其进行TLC鉴别，未对其主要药效活性含量进行测定[21]；在甘草TLC鉴别中采用乙醚回流提取，乙醚挥发性强具有危险性且购买较难，本试验选择在鉴别甘草时改用正丁醇进行回流提取，供试色谱斑点清晰无阴性对照干扰[13]；在桔梗TLC鉴别时展开剂选用石油醚-乙酸乙酯(7∶4)代替三氯甲烷-乙醚(1∶1)，特征斑点圆整清晰，分离效果较好。

清肺颗粒中南葶苈子为君药，在哮喘呼吸道炎症介质-血小板激活因子药理筛选试验中发现，槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷是从南葶苈子中分离出特有的黄酮苷，专属性好，含量较高，稳定性强，且仅存在南葶苈子中[22-23]。因此本试验确定槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷含量作为控制清肺颗粒质量标准控制指标。本研究还考察了乙腈-0.1%磷酸水(15∶85)流动相与乙腈-0.1%醋酸溶液(11∶89)两种流动相不同比例进行考察，结果显示乙腈-0.1%醋酸溶液(11∶89)作为流动相分离效果更好，确定为本试验流动相[24]。根据《中国兽药典》2020版葶苈子中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷以测定含量不得少于0,080 mg。6组不同批次的清肺颗粒中南葶苈子中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷的平均含量为0.1012 mg/g，与利顺欣等采用HPLC法测定南葶苈子中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷平均含量为0.1070 ng/g[25]，姜艳在等HPLC法测定南葶苈子中槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龙胆双糖苷平均含量为0.0946%的结果保持一致[24]。综上所述，所建立的清肺颗粒质量控制专属性强，操作方便，具有较强的专属性和精密性，能够准确反映颗粒剂质量，为控制清肺颗粒质量提供科学依据。

一般鉴别药味采用TLC鉴别，应先选择君臣药、贵重药、毒性药，鉴别药味数占总药味的30%以上，处方中对高效液相色谱成分含量测定方法的可不进行鉴别[24]。对TLC鉴别条件展开剂、点样量、预饱和时间进行改进能使展开效果佳[25]。综上所述，建议《中国兽药典》2020版清肺颗粒作为常见临床应用的兽药，疗效显著，但质量标准相对落后，建议完善清肺颗粒鉴别项与含量测定项可准确反映颗粒剂质量，为控制产品质量提供技术支持。