猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗耐热保护技术的研究

赵玉龙，何平有，刘明超，刘 涛,3，焦玉兰,3*

(1.瑞普(保定)生物药业有限公司，河北保定 071000；2. 河北省兽医生物技术创新中心，河北保定 071000；3. 河北农业大学动物医学院，河北保定 071000)

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of swine, TGE)和猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是常见的主要侵染猪肠道的高度接触性传染病，常发生在冬春季，是猪的常见病，尤其对仔猪危害严重[1-2]，临床表现为哺乳仔猪的急性肠炎、呕吐、腹泻和高死亡率[3]。

目前，疫苗免疫仍是防控该类疫病的主要手段[4]。市场化的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联弱毒冻干活疫苗，其毒力稳定、安全，对仔猪免疫效力确实[5]，但在疫苗生产和使用中仍存在一些问题：一是半成品病毒液保存时间短(-20 ℃保存期仅2个月)；二是冻干活疫苗保存条件高(需在-20 ℃保存，保存期18个月)，疫苗储运过程不稳定，影响免疫效果[6]。疫苗保护剂的成分及其制备、冻干工艺是影响疫苗效果的重要因素，对疫苗保存、运输及免疫效果有很大影响，本研究拟开发一种新型病毒保护剂，提高对病毒保护效果，提升疫苗质量。

本试验通过在常规保护剂(明胶、蔗糖)基础上添加卡波姆、硫酸锌、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮等基质，组成新型保护剂，分别在病毒液保存和疫苗冻干过程添加，通过对病毒液保存效果和疫苗常规检验以及病毒含量、安全性、免疫攻毒保护效果及耐老化试验等项目的对比研究，评价了新型保护剂病毒保护效果。

1 材 料

1.1 病毒液 疫苗毒株为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)HB08株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)ZJ08株。猪传染性胃肠炎半成品病毒液500 mL、猪流行性腹泻半成品病毒液500 mL，均由瑞普公司生产部提供。

1.2 疫苗保护剂成分 蔗糖、聚乙二醇购自天津市科密欧化学试剂有限公司；明胶、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆、硫酸锌购自默克公司。

1.3 试验动物 5日龄猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病毒抗体阴性健康仔猪，购自河北省某养殖场。

2 方 法

2.1 疫苗制备

2.1.1 保护剂的制备 试验用新型保护剂配方：10%明胶、50%蔗糖、5%卡波姆、1%硫酸锌、5%聚乙二醇、5%聚乙烯吡咯烷酮；常规保护剂配方：10%明胶、50%蔗糖。

2.1.2 病毒液制备 猪传染性胃肠炎半成品病毒液、猪流行性腹泻半成品病毒液均由瑞普公司生产部按照《中华人民共和国农业部公告第2323号》(下文简称《公告2323号》)半成品操作规程制备，病毒含量符合公告质量标准。

2.1.3 配苗、分装及冻干 按表1分组及操作方法进行配苗、分装及冻干。

2.2 保护剂保存及冻干效果评估

2.2.1 新型保护剂对病毒液保存效果的影响 按照表2分组方法进行病毒液保存效果试验。

2.2.2 冻干活疫苗常规项目及纯净性检验 按照《中华人民共和国兽药典2020年版三部》(下文简称《中国兽药典》)标准进行检验。

2.2.3 冻干活疫苗效力检验(病毒含量测定) 按照《公告2323号》标准进行检验。

2.2.4 冻干活疫苗免疫攻毒保护试验(测定攻毒保护效果) 按表3分组方法进行攻毒保护试验。

2.2.5 冻干活疫苗安全试验 按表4分组方法进行安全试验。

表1 疫苗分装、冻干试验操作Tab 1 Experimental operating method of loading and lyophilization

表2 病毒液保存效果试验Tab 2 Experiment on preservation effect of disease venom

表3 攻毒保护试验Tab 3 Challenge protection experiment

表4 安全试验Tab 4 Experimental operating method of safety inspection

2.2.6 冻干活疫苗耐老化试验 冻干后各组疫苗随机抽取30支，分别置37 ℃保存15 d，分别测定病毒含量。

2.2.7 冻干活疫苗保存期试验 疫苗保存条件由原来-20 ℃保存改为2～8 ℃保存，常规保护剂冻干活疫苗和新型保护剂冻干活疫苗保存0、6、12、24和36个月，分别测定病毒含量。

3 结果与分析

3.1 病毒液添加新型保护剂冻存效果验证 如表5所示，未添加保护剂的病毒液-20 ℃仅保存2个月。添加新型保护剂的病毒液在-20 ℃保存12个月后，病毒含量均无明显变化，TGEV病毒含量仅下降0.34个滴度，PEDV病毒含量仅下降0.54个滴度。

表5 病毒液保存效果试验结果Tab 5 Experimental results of preservation effect of disease virus content TCID50/mL

3.2 冻干后常规项目及纯净性检验结果 如表6所示，两种冻干保护剂活疫苗，物理性状、真空度、剩余水分和无菌检验结果均符合《中国兽药典》质量标准。在溶解性方面新型冻干保护剂活疫苗明显优于常规保护剂活疫苗。

表6 常规项目及纯净性检测结果Tab 6 Routine tests and purity test results

3.3 冻干活疫苗效力试验(病毒含量测定) 如表7所示，新型保护剂活疫苗TGEV部分效力较常规保护剂活疫苗高0.43个滴度，PEDV部分效力高0.6个滴度。

表7 效力试验结果

3.4 冻干活疫苗免疫攻毒保护试验、安全试验结果 如表8所示，新型保护剂疫苗保护效果优于常规保护剂。新型保护剂活疫苗可提供9.67/10保护，常规保护剂活疫苗免疫攻毒保护为8.33/10；对照组0/10保护。

表8 攻毒保护及安全试验结果Tab 8 Challenge protection and safety test results

3.5 冻干活疫苗耐老化试验结果 如表9所示，新型保护剂活疫苗37 ℃保存15 d，其TGEV部分病毒含量降低0.8个滴度，PEDV部分病毒含量降低0.9个滴度；而常规保护剂活疫苗病毒含量迅速下降，37 ℃保存期不足5 d。

表9 耐老化试验结果(37 ℃保存)

3.6 冻干活疫苗保存期试验结果 如表10所示，新型耐热保护剂活疫苗2～8 ℃保存36个月, TGEV部分病毒含量降低0.3个滴度，PEDV部分病毒含量降低0.5个滴度，且病毒含量高于农业部公告质量标准(≥5.0 lg(TCID50/头份)，在冷藏条件下保存期可长达36个月；常规保护剂活疫苗2～8 ℃保存期仅为6个月。

表10 保存期试验结果(2～8 ℃保存)

4 结论与讨论

高效价的半成品病毒液是生物制品稳定生产的基础。多年的生产实践证明，-20 ℃左右低温保存的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻半成品的效价保存期仅为2个月，对后期成品生产及质量影响很大。近年来本课题组试图查阅文献，寻找解决办法。所阅文献多为-20 ℃以下保存，-15 ℃及以上保存的研究鲜有报道。本试验通过在半成品保存环节添加新型冷冻保存液，使半成品保存期在-15 ℃～-18 ℃环境下由原来的2个月延长到12个月，确保实现常温化苗，提升了病毒稳定性和活性、为生产调度赢得了时间。

选用合适的保护剂对疫苗的质量和长期保存的稳定性至关重要[7]。市场上现有的腹泻二联活疫苗通常为蔗糖、明胶等保护剂，组方简单、保护功能差，2～8 ℃可以冷藏运输、但-15 ℃以下保存期是其两倍[8]，说明其冷藏保存稳定性尚待进一步研究。

本研究在原有明胶、蔗糖基础上添加了PEG、聚乙烯吡咯烷酮等基质，可有效减小病毒在冻干过程中冻干损失，较常规保护剂提升了0.4～0.6个滴度，大分子冷冻保护剂与小分子冷冻保护剂联合使用，显著提升了病毒活性与稳定性。同时，医药级PEG[9-10]和聚乙烯吡咯烷酮溶解性能良好，可与多种药物相溶，提高生物利用度。聚乙烯吡咯烷酮还具有优异的热稳定性，在医药、食品等领域被广泛应用[11]。本试验保护剂中通过添加PEG和聚乙烯吡咯烷酮，充分利用了二者优异的溶解性和热稳定，加速了疫苗溶解度，保护了病毒的抗原性，提高了产品在保存和使用中的稳定性。

本研究在组方中添加PEG、卡波姆和硫酸锌等制备的疫苗具有良好的耐热效果，在2～8 ℃环境保存36个月，效价仅下降0.3个滴度。研究者认为，卡波姆与PEG对冠状病毒具有良好的保护作用，二者在冻干过程中可形成独特的双层结构，包裹在病毒表面形成一种天然屏障，有效阻隔冷冻过程冰晶对病毒囊膜的损伤，另一方面内侧的疏水区结构与病毒嵌合增加病毒自身的稳定性，有效保存病毒的活性。李晏[12]表明卡波姆作为一种高分子聚合物，可促进冷冻干燥过程中的升华，使悬浮于耐热保护剂中的病毒在冷冻干燥过程中能保持存活状态；硫酸锌也具有增强病毒自身稳定性的功能。侯若鑫等[13-14]表明锌是机体多种酶的重要组成成分和激活因子，能够参与细胞内信号传导和代谢增殖，在细胞生长、免疫功能和营养代谢等生理或病理过程中起着关键作用。

综上所述，本试验在半成品病毒液储存时加入含卡波姆等基质的新型保护剂, 可有效延长半成品保存期，保证半成品病毒在常温状态下生物学活性的维持，实现了常温直接融化疫苗半成品，生产工序更简化，且降低了能耗。同时降低了病毒保存和冻干过程中的损伤，采用新型保护剂制备的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗，实现了储运过程中疫苗冷藏保存，提升了疫苗运输过程中的稳定性；且保存期由原来-20 ℃保存24个月延长到2～8 ℃保存36个月。