基于近红外光谱的橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的生长预测

张嘉雯，刘佳元，封雨桐，孙佳怡，周彬静，屠 康，潘磊庆

（南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095）

酸土脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris），又称嗜酸耐热菌，具有耐热嗜酸的特性，不仅能够有效对抗果汁加工时的高温灭菌，而且在pH值为酸性的果汁中也可以很好的生长[1]。果汁在生产制造的高温灭菌时，大部分致病菌和致腐菌均能得到抑制[2]。但由于酸土脂环酸芽孢杆菌的嗜酸、耐热、产芽孢、强抗逆性等特征，其芽孢可以抵抗果汁在加工过程中的杀菌过程而存活下来，因此只要环境条件适当，就能快速在果汁中生长，影响果汁的风味和品质[3]。由酸土脂环酸芽孢杆菌导致的果汁酸败事件经常发生，许多研究和调查结果表明，酸土脂环酸芽孢杆菌广泛分布于果蔬产品生产和加工全过程中[4]，且在大部分果汁中的含量超标[5]。所以酸土脂环酸芽孢杆菌是使得果汁劣变和败坏的主要原因，是在果汁生产加工过程中需要严格控制的微生物[6]。芽孢萌发是细菌生长和繁殖的重要环节，同时失去极端抗性[7]。在酸土脂环酸芽孢杆菌代谢时会产生一些酸性物质，但不会改变果汁本身的酸碱值，只在瓶底显现出一定的浊度[8]。但菌体在代谢时仍会有一些次级代谢产物出现，比如2,6-二氯苯酚、邻甲氧基苯酚和2,6-二溴苯酚，导致果汁发生腐败变质[9]。

预测微生物学是用于预测微生物对于特定环境变量反应的数学模型[10]，可以有效的管理微生物安全风险，它依靠数据库，并结合计算机来预测食品中微生物的生长或残余变化[11]。预测微生物模型通常可以分为2类，包括一级模型和二级模型[12]。一级模型主要是用来描述时间和微生物的生长数量之间的关系[13−14]，Gompertz模型、Baranyi模型及Huang模型等都是常用的初级模型[15]。二级模型是用来描述环境因素对一级模型中参数的影响，主要包含平方根模型、响应面方程等[13−14]。腐败菌以及一些食源性致病菌在食品生产、加工、储存和运输中的变化是预测微生物学的重要研究内容。微生物生长或死亡的状况主要是通过微生物预测模型的构建来进行预测的，可为食品质量安全提供重要的参考[16]。目前，国内外关于橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的生长预测模型的研究相对较少，主要包括平板计数法、分子生物学方法、免疫学方法等[5]，但是这些检测手段均难以实现生产线上进行快速识别预测及控制。

微生物预测模型已被广泛应用于食品领域，但大部分模型是在培养基培养条件下建立的[17]，不仅操作复杂，并且耗时费力。因此更需要开发快速高效的方法来作为微生物预测模型的数据来源。近红外光谱法是用来分析红外光和可见光之间波长范围的一种方法，该方法操作便捷、效率高，不消耗样品，成本较低，在同一时间可以完成多种不同化学指标的检测，并且在检测过程中不会产生污染，已被广泛应用于食品检测、微生物研究、药物分析等多个领域[18]。微生物样本的近红外光谱由其结构和组成信息构成，因此，样本的光谱与样本的组成特性参数之间有较好的相关性[19]。目前，尚未有采用近红外光谱技术对橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌快速检测的研究。

因此，本研究以橙汁为研究对象，通过测定在正常空气湿度和气体成分下，4、20、40 ℃三种不同温度橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的含量，来分析酸土脂环酸芽孢杆菌对橙汁品质的影响，同时利用近红外光谱技术，结合化学计量学，建立光谱与酸土脂环酸芽孢杆菌的联系。将近红外光谱预测的酸土脂环酸芽孢杆菌菌落数作为数据来源，通过“一步法”构建橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的生长预测模型，并将近红外光谱获得预测菌落数构建的生长模型与平板计数法构建的生长模型进行相关性分析，为橙汁生产加工中酸土脂环酸芽孢杆菌的快速识别预测与控制提供了理论方法和技术支持，为保障橙汁加工产品和行业的健康、快速发展提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸土脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris） 菌种编号CMGCC 1.1801，购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，在4 ℃条件下保藏于南京农业大学食品科技学院实验室；赣南脐橙（Citrus sinensis（L.） Osbeck） 购自南京市玄武区苏果超市（铁匠营社区店）；营养肉汤培养基 上海盛思生化科技有限公司；BAT培养基 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

紫外超净台 苏州苏净安泰有限公司；立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；恒温恒湿培养箱 南京贝蒂实验仪器有限公司；MXW-20DL型涡旋混合仪 杭州齐威仪器有限公司；ANTARIS傅里叶变换近红外光谱仪 美国 Thermo Nicolet 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理与接种 将酸土脂环酸芽孢杆菌菌种转接至营养肉汤培养基，于40℃条件下培养24 h进行活化，在相同条件下进行二次活化后，用无菌生理盐水将活化好的酸土脂环酸芽孢杆菌制成菌悬液，并调整浓度至102～103CFU/mL，备用。

挑选大小形态一致、新鲜的脐橙，清洗、去皮、榨汁，用纱布过滤装于玻璃瓶中，采用巴氏杀菌法进行灭菌处理[5]。在无菌环境下，将活化的酸土脂环酸芽孢杆菌菌悬液接入橙汁，并用10 mL的离心管进行分装，使用封口膜进行封口处理，置于4、20、40 ℃的恒温培养箱中分别贮藏288、120、46 h。贮藏过程中在合适的时间间隔取出5个橙汁样品用于近红外光谱检测和微生物含量检测。

1.2.2 微生物含量的测定 在无菌环境下，将每10 mL的样品放置于无菌袋中，加入90 mL生理盐水缓冲液，使用涡旋混合仪混合均匀，获得酸土脂环酸芽孢杆菌悬液。按照一定的稀释度进行稀释，选择2～3个合适的梯度，取100 μL涂布于BAT培养基上，于40 ℃恒温培养箱中培养（48±1） h后进行平板计数。

1.2.3 近红外光谱扫描与采集 将 Antaris Ⅱ 傅里叶变换近红外光谱仪调整到透射模式，进行样本近红外光谱数据的采集。采集光谱前以空气为背景进行背景光谱采集，取不同温度下的橙汁样本进行近红外透射光谱的扫描，每个样本重复采集3次，取其平均光谱作为该样本的原始光谱。采集光谱所用参数设置如下：扫描次数为32次，增益8x，分辨率为16 cm−1，扫描波数范围为10000～4000 cm−1。

1.2.4 近红外光谱数据处理与评价方法 近红外光谱预处理可以消除尖峰、杂散光、噪声等干扰。本文采用的预处理方法包括标准化（Autoscale）、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、标准正态变换（standard normal variate，SNV）、去趋势化（Detrend）。其中，标准化（Autoscale）可以同时实现数据的中心化和标准化，主要解决各变量之间因单位不同所引起的权重不同的问题[20]；标准正态变换（SNV）可以对由样品不均匀导致的散射所引起的误差进行校正；多元散射校正（MSC）作用与标准正态变换（SNV）类似[21]；去趋势化（Detrend）可以将分析集中在数据趋势本身的波动上，消除获取数据时产生的偏移对后续计算的影响。

在现代近红外光谱技术中，偏最小二乘法（partial least squares，PLS）是一种被广泛应用的线性建模方法，此方法通过提取光谱数据的特征向量，实现光谱数据的压缩和降维[22]。模型根据校正决定系数（calibration determination coefficient，Rc2）、预测决定系数（prediction determination coefficient，Rp2）、校正均方根误差（root mean square error of calibration，RMSEC）、预测均方根误差（root mean square error of prediction，RMSEP）和相对分析误差 （relative percent deviation，RPD），对模型的预测性能进行评价。当模型的Rc2、Rp2>0.9且RMSEC与RMSEP较小时，可以认为该模型的准确度较高、性能稳定。RPD一般用于评价模型的预测能力，RPD≥1.4表示模型可行，RPD<1.4则说明该模型不可用于实际样品定量检测[23]。其中，决定系数、均方根误差和剩余预测偏差的计算公式如式（1）、（2）、（3）所示[23]。

式中：yi为样本实测值；ya为样本实测均值；yp为样本预测值；SD为预测集酸土脂环酸芽孢杆菌含量的标准差。

1.2.5 “一步法”建模与模型评价

1.2.5.1 一级模型 传统的微生物预测建模一般使用两步法，即分别构建一级模型和二级模型，在数据分析时会产生较大的误差。“一步法”是以微生物生长数据的整体优化分析为基础，同时构建一级模型和二级模型，误差较两步法更小，对微生物的生长预测也更为准确。因此，“一步法”在预测微生物学建模中更有优势[24]。

酸土脂环酸芽孢杆菌在橙汁中的生长曲线呈现滞后期、指数期和稳定期三个阶段，因此，选取Huang模型[25−26]和No-lag phase模型[27−28]作为一级模型来描述酸土脂环酸芽孢杆菌在橙汁中的生长，Huang模型的方程见式（4）、（5）和（6），No-lag phase模型的方程见式（7）。

式中， Ymax为细菌最大生长浓度（lg CFU/mL）；Y为t时刻细菌的浓度（lg CFU/mL）；Y0为初始阶段细菌的生长浓度（lg CFU/mL）； µmax为细菌最大生长速率（h−1）；t为时间（h）；h0为细菌所处的状态；A、α、m为系数。

1.2.5.2 二级模型 分别采用Full temperature range Ratkowsky平方根模型[29]和Suboptimal Ratkowsky平方根模型[30]作为二级模型来评价橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌生长速率受温度的影响。其中Full temperature range Ratkowsky平方根模型的方程见式（8），Suboptimal Ratkowsky平方根模型的方程见式（9）。

式中，µmax为 细菌最大生长速率（h−1）；T0为细菌最低生长温度（℃）；Tmax为细菌最高生长温度（℃）；a、为系数，Ratkowsky 平方根估测的T0只是理论意义上的最低存活温度，一般来说会低于细菌在实际生长环境中的最低生长温度。

1.2.5.3 评价方法 通过均方误差（mean square error，MSE）、均方根误差（root mean square error，RMSE）、赤池信息准则（akaike information criterion，AIC值）[31]评价模型的适用性及拟合度，其计算公式如式（10）、（11）、（12）所示。

式中，n为实测值的数量；RSS为残差平方和；p为模型参数数量。

选取2组恒定温度（4、20、40 ℃）条件下的生长数据来构建和验证模型及参数的准确性，并采用准确因子（accuracy factor，Af）和偏差因子（bias factor，Bf）来评价模型的可靠性[32]。Af和Bf按式（13）、（14）计算。

式中：N实测为 菌落数的实测值（CFU/mL）；N预测为菌落数的预测值（CFU/mL）；n为实验次数。

1.3 数据处理

本研究采用Matlab R2016a和WPS office Excel分析软件处理近红外光谱数据；采用预测微生物学专用软件IPMPGlobalFit对橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的生长数据进行拟合处理，并用OriginPro软件作图。

2 结果与分析

2.1 近红外定量模型的建立

三个温度（4、20、40 ℃）的橙汁样品原始透射光谱如图1所示。在4000～10000 cm−1波长范围内，不同温度的橙汁样品表现出基本相同的光谱形态，趋势基本一致。近红外光谱反映的是含氢基团X-H（X=C、N、O）振动的倍频吸收与合频吸收[33]，游离OH基团吸收峰在3590～3650 cm−1处。由图1知，在波长8000和10000 cm−1附近有明显的吸收峰，且峰值处透光率不同，8500～9000 cm−1有明显的伸缩振动，避开了水分子吸收峰的干扰。

图1 三个温度下橙汁样品的透射近红外光谱图Fig.1 Transmission near-infrared spectra of orange juice samples at three temperatures

为了比较不同的预处理方法对三个温度橙汁样品中酸土脂环酸芽孢杆菌预测模型性能的影响，将三个温度的橙汁样品所测得的光谱数据合并处理。三个温度橙汁样品在光谱扫描和微生物实验的过程中存在少数样品测量结果异常，本研究采用主成分分析法（Principal components analysis，PCA）对三个温度橙汁样品光谱数据进行进行异常值剔除，以提高模型准确度。

按照校正集与验证集之比近似为3:1的比例多次运行Matlab自带的随机算法以获取较好的分集结果，其中60个样本组成校正集，另外20个样本组成验证集。如表1所示，三个温度的橙汁样品校正集的酸土脂环酸芽孢杆菌含量最小值为2.259 lg CFU/mL，最大值为5.449 lg CFU/mL，平均值为4.233 lg CFU/mL，标准差为0.479 lg CFU/mL。

表1 三个温度的橙汁样品校正集与验证集的酸土脂环酸芽孢杆菌含量Table 1 Content of Alicyclobacillus acidoterrestris in the calibration set and validation set of orange juice samples at three temperatures

采用Autoscale、MSC、SNV、Detrend光谱预处理后分别建立PLS预测模型，为后续生长拟合提供参考。其中三个温度的橙汁样品中酸土脂环酸芽孢杆菌含量的PLS模型预测效果如表2所示。

表2 三个温度的橙汁样品中酸土脂环酸芽孢杆菌PLS模型的预测结果Table 2 Results of PLS model for Alicyclobacillus acidoterrestris in orange juice samples at three temperatures

由表2和图2可以看出，预处理方法不同，对原始光谱的影响效果也有所不同，选择合适的预处理方法才能够改善模型的性能。与橙汁样品原始光谱建模效果相比，由MSC和SNV预处理后模型的Rc2值优于原始光谱建模，但是由MSC和SNV预处理后模型的Rp2和RPD值均不如原始光谱建模，预测效果不佳。但用Autoscale和Detrend处理后的光谱所建立的模型Rp2值均优于原始光谱模型，模型RPD均在1.5～2.0之间，预测结果较好。综合比较得出Autoscale预处理方法建立的模型预测性能相对较佳。

图2 Autoscale-PLS模型估计的酸土脂环酸芽孢杆菌含量测量值和预测值的散点图Fig.2 Scatter plots of measured values and predicted values of Alicyclobacillus acidoterrestris contents estimated by Autoscale-PLS model

利用近红外光谱建立预测模型提供便捷、准确的无损检测方法，具有广泛的应用前景。王军[34]利用近红外光谱建立的线性判别模型对苹果汁中不同嗜酸耐热菌鉴别，准确率达到93.75%，表明傅里叶变换红外光谱结合多元统计分析可以对嗜酸耐热菌不同菌株进行快速准确的鉴别。杨康[35]建立了嗜酸耐热菌的红外快速检测模式，并且对嗜酸耐热菌胞内的脂肪酸进行红外分析，研究表明通过红外光谱特征可以对嗜酸耐热菌进行快速鉴定和检测。Mengshi等[36]研究发现使用近红外光谱技术可以快速判别果汁是否被脂环酸芽孢杆菌污染。张亮[37]利用近红外光谱分析技术研究了鲜榨苹果汁和浓缩苹果汁中展青霉素的定性定量检测，用矢量归一法预处理光谱得到鲜榨苹果汁中展青霉素检测模型的决定系数为0.921，内部交叉检验的预测集决定系数为0.907，RMSEP为0.264 μg/L；用最大最小归一化法预处理光谱得出浓缩苹果汁中展青霉素检验模型的决定系数为0.935，内部交叉检验的预测集决定系数为0.927，RMSEP为0.532 μg/L，研究表明近红外光谱分析技术能够用于鲜榨苹果汁和浓缩苹果汁中展青霉素的快速检测。

本研究发现三个温度的橙汁样品中酸土脂环酸芽孢杆菌的原始光谱建立的PLS模型Rp2为0.677，RMSEP为0.269 lg CFU/mL，RPD为1.726；4种不同预处理方法中，Autoscale预处理光谱后建立的PLS模型的效果相对较好，Rp2为0.733，RMSEP为0.242 lg CFU/mL，RPD为1.919。说明利用近红外光谱分析技术建立模型来预测橙汁样品中酸土脂环酸芽孢杆菌的生长是可行的。

2.2 基于近红外光谱预测菌落数的生长模型构建

酸土脂环酸芽孢杆菌属于嗜热菌，在低温环境生长会受到抑制，所以4 ℃培养初期，橙汁样品中酸土脂环酸芽孢杆菌的数量增长不太明显，仅在培养后期有所增加，但生长曲线不完整。当培养温度为20、40 ℃时，橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的生长比较迅速，其生长曲线完整，包括迟滞期、对数期和稳定期三个阶段。

本文使用“一步法”数值分析方法对傅里叶近红外光谱仪预测的橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌菌落数进行分析拟合，即一级模型和二级模型组合直接构建生长模型。主要使用4种一级和二级模型组合后的混合模型，分别为Huang-Full temperature range Ratkowsky模型（命名缩写为Huang-full模型）、No-lag phase-Suboptimal Ratkowsky模型（命名缩写为Nosub模型）、No-lag phase-Full temperature range Ratkowsky模型（命名缩写为No-full模型）、Huang-Suboptimal Ratkowsky 模型（命名缩写为Huang-sub模型），对4、20、40 ℃条件下光谱预测菌落数的生长数据进行分析时，数值分析迅速收敛。结果如表3～表6 所示。

表3 Huang-Full temperature range Ratkowsky模型参数Table 3 Parameters of Huang-Full temperature range Ratkowsky model

根据表3、表5可知，由Huang-full模型和No-full模型拟合的橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的最低生长温度均为10.30 ℃，最高生长温度分别为58.40和59.20 ℃。两种模型估计的最大生长浓度分别为5.41和5.47 lg CFU/mL。据表4、表6可知，由No-sub模型和Huang-sub模型拟合的橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的最低生长温度分别是11.20和10.70 ℃。两种模型估计的最大生长浓度分别为5.35和5.33 lg CFU/mL。据研究可知，酸土脂环酸芽孢杆菌嗜酸、耐热，是一种好氧型的革兰氏阳性菌，生长pH范围在2.5～6.0之间，生长温度在25～60 ℃之间[38]。杨康[35]经过试验得到标准嗜酸耐热菌的生长温度为28～60 ℃；分离嗜酸耐热菌的生长温度为24～60 ℃，并且通过建立嗜酸耐热菌的生长模型，从标准菌株的生物量模型中预测出标准嗜酸耐热菌的的最大生物量约为660 mg/L。冯鑫等[39]通过探索各种营养因子对酸土脂环酸芽孢杆菌生长的影响，得出当培养液不含葡萄糖时，酸土脂环酸芽孢杆菌的菌体总数可达7.06 lg CFU/mL；当培养基中葡萄糖浓度增加到2 g/L时，酸土脂环酸芽孢杆菌的菌体总数为7.66 lg CFU/mL。唐翠娥等[6]通过研究橙汁中主要营养成分对脂环酸芽孢杆菌生长的影响，发现当橙汁浓度为100%时，脂环酸芽孢杆菌的生长浓度约为4.18 lg CFU/mL。本研究中，Huang-full模型和Nofull模型拟合出的酸土脂环酸芽孢杆菌最高生长温度和文献接近，且4种模型得到的最低生长温度均较低。

表4 No-lag phase-Suboptimal Ratkowsky模型参数Table 4 Parameters of No-lag phase-Suboptimal Ratkowsky model

表5 No-lag phase-Full temperature range Ratkowsky模型参数Table 5 Parameters of No-lag phase-Full temperature range Ratkowsky model

表6 Huang-Suboptimal Ratkowsky模型参数Table 6 Parameters of Huang-Suboptimal Ratkowsky model

参数MSE、RMSE、AIC是评价模型拟合精度的重要指标，通常值越小，模型拟合的精度越高。可以看出，Huang-sub模型和No-full模型的RMSE、MSE、AIC相近，无显著差异，可以认为这2种模型可以较好的拟合近红外预测橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的生长曲线。结果表明除No-sub模型，其他3种模型均能很好地拟合酸土脂环酸芽孢杆菌的生长，且Huang-full模型的3种指标相较更小，所以拟合的精度最高。因此相较于其它模型，Huang-full模型更适合描述温度对橙汁样品中酸土脂环酸芽孢杆菌生长的影响。将近红外光谱获得预测菌落数构建的四种生长模型与平板计数法构建的生长模型分别进行相关性分析，可以看出Huang-full模型构建的相关性最高，r为0.963；No-sub模型构建的相关性最低，r为0.907。总的来说，4种模型的相关系数均大于0.900，且Huang-full模型的拟合效果最优。因此，可以判断基于近红外光谱预测菌落数建立的生长模型，可以代替基于平板计数构建橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的生长模型。

根据近红外预测的橙汁在4、20、40 ℃条件下贮藏过程中酸土脂环酸芽孢杆菌的菌落数，分别利用Huang-full模型、No-sub模型、No-full模型和Huang-sub模型拟合得到生长曲线（如图3所示）。随着培养温度的升高，菌群从迟滞期进入对数期的时间缩短，对数期内菌群的生长速率也随着温度的升高而增大。

图3 4种模型在不同温度条件下拟合的近红外光谱预测橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的生长曲线Fig.3 Growth curves of Alicyclobacillus acidoterrestris in orange juice predicted by NIR spectra under different temperature conditions by four models

对近红外光谱获得预测菌落数构建的模型进行验证，验证结果见表7。计算得出4种模型在各恒定温度（4、20、40 ℃）条件下，近红外光谱预测得到的橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌菌落数的Af和Bf值。由表7可知，所建立的模型Af在1.014～1.103之间，Bf在0.971～1.074之间，且都较接近1.000，说明本实验所建立的模型可靠性和稳定性较高。因此，4种模型在3个贮藏温度下都具有较好的拟合效果，可以较好地预测橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌在不同贮藏温度下菌落总数的变化。说明近红外光谱技术能够较为准确的预测橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的菌落总数，且基于预测菌落数构建的模型较为稳定。

表7 4种模型在不同温度条件下的验证结果Table 7 Validation results of four models under different temperature conditions

3 结论

研究基于橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌在4、20、40 ℃这3个温度下的近红外光谱和平板菌落计数法获得的微生物信息，采用“一步法”对近红外光谱预测的橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的生长数据进行分析，分别建立了Huang-full模型、No-sub模型、No-full模型和Huang-sub模型。结果表明，4种预测模型的MSE值介于0.0046～0.0300 lg CFU/mL之间；RMSE值介于为0.068～0.173 lg CFU/mL之间；AIC值介于−66.383～−53.944之间，且Huang-full模型的3种指标相较更小，所以是描述橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌生长的最适模型，在不同温度条件下拟合度都较好。将近红外光谱获得预测菌落数构建的4种生长模型与平板计数法构建的生长模型分别进行相关性分析，其相关系数均大于0.900，且Huangfull模型的拟合效果最优。因此，可以证明基于近红外光谱预测菌落数建立的生长模型，可以代替基于平板计数构建橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌的生长模型。所构建的模型通过Af和Bf值进行验证，证实模型均具有良好的可靠性。研究结果为有效监控橙汁中酸土脂环酸芽孢杆菌污染提供一定的参考，但在实际生产应用中，橙子品种、生产工艺波动等因素均有可能引起橙汁中的各成分的含量波动，若含量波动超出所建立的近红外模型范围，则会影响模型的预测精度。