鹿茸多肽对训练创伤致脊髓损伤模型大鼠的作用及机制*

廖军锋，王虹，龙桂花，吕晓宇△，苏建

（1.中国人民解放军南部战区总医院，广东 广州 510010；2.广东省第二中医院，广东 广州 510095）

军事训练或体育训练过程中，防护不当、训练方法不科学或意外均易导致脊柱骨折，并伴随脊髓损伤（SCI）［1］。SCI 引发的神经性疼痛是一种严重的慢性疼痛［2］，目前已有关于SCI 致神经性疼痛的治疗方案和潜在作用机制研究，但其治疗仍具有极大挑战［3］。临床常用非甾体抗炎药、阿片类药物及其衍生物治疗疼痛［4］，对急性疼痛有一定疗效，但无法治愈神经性疼痛［5］。研究表明，神经损伤或SCI在脊髓中诱导促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族c-Jun 氨基端蛋白激酶（JNK）和p38 等的深度活化［6］。故选择合适的靶分子抑制MAPK的激活可能是一种有效的镇痛策略。多聚嘧啶序列结合蛋白（PTB）是一种重要的神经元分化调节蛋白［7］，可诱导胶质细胞分化为神经元，在神经退行性疾病中发挥神经元保护作用［8］。另外，PTB 通过与早期生长应答因子2（EGR2）结合，可调节白细胞介素1β（IL-1β）和p38-MAPK的信号通路［9］。但尚不明确PTB对SCI的修复作用，故寻找安全、有效的分子抑制PTB 可能是治疗SCI 的有效方法。鹿茸多肽（VAP）提取于鹿茸，是一种富含生物活性多肽的混合物。《本草纲目》记载，鹿茸具有补肾养骨、延年益寿的功效。VAP 被广泛用于增强性功能，抑制炎症，促进软骨细胞增殖，延缓衰老，对神经细胞分化的促进功能明显［10］，在治疗骨关节炎疾病中发挥关键作用［11］。本研究中探讨了VAP 对训练创伤致SCI 模型大鼠痛觉、神经炎症及PTB 介导神经修复作用的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：Von Frey纤维丝（上海玉研科研仪器有限公司，型号为NC12775-01 至NC12775-20，质量为0.008～300.000 g）；37300 型辐射热刺痛仪（意大利UGO Basile公司）；GE LAS 4000 mini 型分子成像仪（美国GE 公司）；CKX53 型荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）；Lecia CM1860 UV型冷冻切片机（徕卡生物系统有限公司）。

试药：MSI-1436（PTB 抑制剂，美国MCE 公司，批号为HY-12219A，纯度不低于95.0%）；VAP（上海德翅生物科技有限公司，批号为DC168002011，纯度不低于98.0%）；磷酸化p38（p-p38）抗体（Tyr182，批号为4511，1∶800），PTB 抗体（批号为72669，1∶1 000），磷酸化胞外信号调节激酶（p-ERK）1/ 2 抗体（Thr202/Tyr204，批号为9101，1∶1 000），磷酸化JNK（p-JNK）抗体（Thr183/Tyr185，批号为4668，1∶1 000），抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）辣根过氧化物酶（HRP）抗体（二抗，批号为7074，1∶3 000），抗兔IgG HRP 抗体（二抗，批号为7076，1∶3 000），均购自美国Cell Signaling Technology 公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（美国Sigma-Aldrich 公司，批号为SAB1410512，1∶5 000）；神经元特异性烯醇化酶（NSE）抗体（批号为ab180943，1∶100），IL-1β抗体（批号为ab216995，1∶1 000），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抗体（批号为ab109322，1∶1 000），均购自美国Abcam 公司；荧光二抗Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG试剂盒（美国Jackson Laboratories公司，批号为711-547-003，1∶300）。

动物：无特定病原体（SPF）成年雄性SD大鼠，48只，6 周龄，体质量206～229 g，动物生产许可证号为26-2001A008，购于广东省医学实验动物中心。在无病原饲养条件下，每笼养5～6只，维持室温为（22±2）℃，12 h/12 h明暗循环。所有动物的使用均通过中国人民解放军南部战区总医院动物护理和使用委员会的审查和批准，并严格遵守国际疼痛研究协会（IASP）清醒动物疼痛实验守则。

1.2 方法

分组、建模［12］与给药：将48 只SD 大鼠随机分为空白（Control）组，模型（SCI）组，阳性对照（MSI-1436）组及VAP 低、中、高剂量组（20，40，60 mg/kg），各8 只。适应性饲养2 d后，用4%戊巴比妥钠麻醉大鼠，于后右侧大腿中部暴露坐骨神经7 mm，在暴露的7 mm 坐骨神经段中间每隔1 mm选1个位置，共选择4个位置使用4-0铬色肠线进行结扎，然后逐层缝合。Control 组大鼠暴露坐骨神经后不进行结扎，直接进行逐层缝合。建模成功后，Control 组、SCI 组大鼠不给予药物治疗，仅给予等量生理盐水；MSI-1436 组大鼠术后14 d 鞘内注射4 μg MSI-1436（溶于20 μL 生理盐水）1 次（单次给药），并于术后15，16 d 各给药1 次（连续给药）；VAP 低、中、高剂量组大鼠术后14 d 分别腹腔注射20，40，60 mg/ kg VAP 1 次（单次给药），并于术后15，16，17，18 d 各给药1 次（连续给药）。

SCI 相关疼痛行为评估：适应性饲养2 d后，在正式测试前1 d 进行基线测试。通过Von Frey 纤维丝测定大鼠机械痛觉阈值，取大鼠置架于金属网上的塑料盒子中适应30 min，用一组质量为0.008～26.000 g的Von Frey纤维丝垂直刺激每只大鼠手术侧后足的足底表面，记录大鼠抬足时使用的纤维丝刻度值，排除大鼠自主性抬足。每只大鼠测试3遍，并计算平均值。测试大鼠足底对热刺激的缩足潜伏期，使用辐射热刺痛仪提供热源，取大鼠置光滑且可控温度的玻璃地板的盒子中，将热源聚焦在后足底表面，向该部位传递辐射热刺激（保持恒定），后足缩回时关闭刺激，记录抬足的热痛觉潜伏期，排除大鼠自主性抬足。每只大鼠测试3遍，并计算平均值。

免疫印迹（Western blot）法检测PTB 和MAPK 信号通路p-JNK，p-p38，p-ERK 及促炎因子IL-1β，TNF-α蛋白的表达水平：取L1-6处脊髓段，用冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，匀浆后在蛋白裂解缓冲液中裂解，将裂解物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，电泳转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室温下用5%胎牛血清白蛋白封膜1 h，4 ℃下同一抗［p-p38 抗体（Tyr182，1∶800），PTB 抗体（1∶1 000），p-ERK 1/2抗体（Thr202/Tyr204，1∶1 000），p-JNK 抗体（Thr183/ Tyr185，1∶1 000），GAPDH 抗体（1∶5 000）］孵育过夜，随后与二抗［抗小鼠IgG HRP抗体（1∶3 000）或抗兔IgG HRP抗体（1∶3 000）］室温孵育2 h。经增强型化学发光（ECL）显色液显色后，使用分子成像仪进行成像、拍照，并使用Image-Pro Plus 6.0软件分析数据［11］。

免疫荧光化学法定位NSE：大鼠经水合氯醛深度麻醉后，心脏灌注PBS，注入4%多聚甲醛，将L4-5 腰节切开并固定在多聚甲醛中，使用冷冻切片机切成20 μm厚度的切片，将切片与抗NSE 抗体（1∶100）于4 ℃孵育过夜，随后用PBS洗涤，并与二抗Alexa Fluor 488 Affini-Pure Donkey Anti-Rabbit IgG 室温孵育2 h。用PBS 洗涤，在荧光显微镜下观察其NSE免疫荧光染色情况［13］。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 镇痛作用及对p-JNK，p-p38，p-ERK 蛋白表达水平的影响

SCI模型构建：与Control组比较，SCI组大鼠的机械痛觉阈值在术后17 d 降至最低，热痛觉潜伏期在术后14 d 降至最低，并持续至术后21 d（t=18.261，14.227，P=0.024，0.031），详见图1 A 和图1 B。与Control 组比较，SCI 组大鼠脊髓中PTB 蛋白表达水平显著升高（t=20.320，P=0.003），详见图1 C 和图1 D。结果表明，SCI模型构建成功。

镇痛作用：1）单次给药。考察SCI 术后14 d 给药0，0.5，2.0，4.0，8.0，24.0 h 时大鼠的机械痛觉阈值和热痛觉潜伏期。与SCI 组比较，MSI-1436 组及VAP 中、高剂量组大鼠单次给药2.0，4.0，8.0 h 时同侧足的机械痛觉阈值均显著升高，热痛觉潜伏期均显著延长（F=126.029，205.663，P=0.000，0.002；F=152.554，203.431，P=0.021，0.003）。详见图2 A、图2 B、图3 A和图3 B。2）连续给药。考察SCI 术后连续给药3，5 d，每天给药2.0 h 时大鼠的机械痛觉阈值和热痛觉潜伏期。与SCI 组比较，MSI-1436 组大鼠连续给药3 d 及VAP中剂量组大鼠连续给药5 d时同侧足的机械痛觉阈值均显著升高，热痛觉潜伏期均显著延长（F=216.011，128.052，P=0.002，0.009；F=139.028，188.122，P=0.019，0.006）。详见图2 C、图2 D、图3 C 和图3 D。结果表明，VAP可减轻SCI诱导的疼痛反应。

注：与Control组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。图2至图4同。A.机械痛觉阈值 B.热痛觉潜伏期 C，D.PTB蛋白表达水平图1 SCI模型大鼠疼痛行为和PTB蛋白表达水平比较Note：Compared with those in the Control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001（for Fig.1-4）.A.Mechanical pain threshold B.Thermal pain latency C，D.Expression level of PTBFig.1 Comparison of pain behavior and PTB expression level in SCI model rats

对MAPK 激酶的作用：与Control 组比较，SCI 组大鼠脊髓中p-p38，p-JNK，p-ERK 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与SCI 组比较，MSI-1436 组和VAP低、中、高剂量组大鼠脊髓中p-p38 和p-JNK 蛋白表达水平均显著降低（F=133.080，156.233，P=0.026，0.015；F=188.380，192.106，P=0.002，0.011）。详见图2 E 和图2 F。与SCI 组比较，VAP 低、中、高剂量组大鼠脊髓中给药8 h后的p-p38和p-JNK 蛋白表达水平均显著降低（F=188.380，192.106，P=0.002，0.011），给药2 h 后的PTB 蛋白表达水平均显著降低（F=152.080，P=0.022）。详见图3 E、图3 F、图3 G 和图3H。结果表明，VAP 可逆转SCI 诱导的PTB 和MAPK 激酶表达水平的升高。

2.2 对脊髓神经的修复作用

与Control 组比较，SCI组大鼠脊髓中NSE 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与SCI 组比较，VAP 中、高剂量组大鼠脊髓中NSE 的表达水平显著降低（P=0.015，0.023）。详见图4 A 和图4 B。结果表明，VAP 对SCI模型大鼠的脊髓神经具有修复作用。

2.3 可抑制脊髓神经的炎性反应

与Control 组比较，SCI 组大鼠脊髓中IL-1β 和TNF-α 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与SCI组比较，VAP低、中、高剂量组大鼠脊髓中IL-1β和TNF-α蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。详见图4 C 和图4 D。结果表明，VAP可抑制SCI诱导的脊髓神经的炎性反应。

3 讨论

PTB蛋白是一种聚嘧啶束结合蛋白，主要表达于神经系统。神经发育过程中，PTB表达上调，而当神经元成熟时，PTB 的表达水平反而降低。此程序对神经系统的发育至关重要，故PTB 在神经元诱导和保护神经元的成熟中起着重要作用。目前，已发现敲除PTB 为非神经元细胞转化为神经元的必要充分条件［14］。另外，氧化应激、TNF-α 刺激等外界刺激可使丝氨酸/苏氨酸激酶结构域磷酸化，并激活PTB［15］。

研究表明，MAPK 特别是JNK 和p38 的激活，可导致神经病理性疼痛［16］，慢性收缩引起的坐骨神经损伤可诱导脊髓背角JNK 和p38 的显著活化［17］。啮齿动物模型中，p38 抑制剂和JNK 抑制剂可改善神经性疼痛症状［18-19］。作为JNK 和p38 的上游，抑制PTB 可明显降低炎性疾病中IL-1β 和p38-MAPK 的表达水平［20］。但有关PTB 在慢性疼痛中作用的研究极有限。故本研究中设计了相关实验，以评估PTB 在SCI诱导的神经性疼痛中的作用，发现SCI可引起大鼠明显的机械异常性疼痛和热痛觉过敏，诱导腰部脊髓PTB的上调，故本研究中探讨了PTB激活对SCI诱导的神经性疼痛是否具有功能意义。结果显示，单次给药或连续给药PTB抑制剂MSI-1436均可显著减轻SCI 引起的机械性异常性疼痛和热痛觉过敏；显著抑制SCI 诱导的p-JNK 和p-p38 的上调，但对p-ERK 表达水平无明显影响，表明PTB 是JNK 和p38 而非ERK 的上游调节剂。同时，发现VAP 可有效抑制SCI 诱导的PTB 表达水平的升高，从而抑制PTB 蛋白在脊髓中的表达。由此可知，VAP 可通过抑制PTB 减轻SCI诱导的神经性疼痛。

A，B.单次给药机械痛觉阈值和热痛觉潜伏期 C，D.连续给药机械痛觉阈值和热痛觉潜伏期 E，F.给药8 h后p-JNK，p-p38，p-ERK蛋白表达水平 G，H.给药2 h后PTB蛋白表达水平图3 VAP对SCI模型大鼠疼痛行为和p-JNK，p-p38，p-ERK，PTB蛋白表达水平的影响A，B.Mechanical pain threshold and thermal pain latency after the single administration C，D.Mechanical pain threshold and thermal pain latency after the continuous administration E，F.Expression levels of p-JNK，p-p38 and p-ERK proteins 8 h after administration G，H.Expression level of PTB 2 h after administrationFig.3 Effects of VAP on the pain behavior and expression levels of p-JNK，p-p38，p-ERK and PTB in SCI model rats

PTB在神经元和神经胶质细胞中均有表达，并在神经炎症的诱导和维持中起重要作用。研究发现，抑制PTB 可减少神经胶质细胞中TNF-α，IL-1β 等炎性因子的释放［8-9，20］。这些炎性因子均是疼痛致敏过程中的重要介质。本研究结果显示，VAP 在SCI 中显著抑制了神经损伤标志物NSE 的高表达，并抑制了TNF-α 和IL-1β的表达。

A.NSE病理生理图 B.NSE蛋白表达水平 C，D.IL-1β和TNF-α蛋白表达水平图4 VAP对SCI诱导的神经损伤和炎性因子表达水平的影响A.Diagram of NSE pathophysiology B.Expression level of NSE protein C，D.Expression levels of IL-1β and TNF-α proteinsFig.4 Effect of VAP on the SCI-induced nerve injury and expression levels of inflammatory factors

综上所述，VAP 下调了SCI 诱导的PTB 蛋白表达水平的升高，可预防神经性疼痛相关的异常性疼痛和热痛觉过敏，促进神经修复，并减轻炎症。