Box-Behnken 响应面法优选贵州产青椒精油提取工艺*

罗忠圣，黎浪，严艳芳，郑前方，吴红，徐昌艳，覃容贵△

（1.省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳 550014；3.贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550025；4.贵州省德江县民族中医院，贵州 铜仁 565200）

花椒为芸香科植物青椒Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc.或花椒Zanthoxylum bungeanumMaxim.的干燥成熟果皮，为常用食品调味料，且药食两用，收载于历版《中国药典》，其性温，归脾、胃、肾经，具有温中散寒、除湿、杀虫、止痒等功效［1］。药理学研究表明，花椒具有镇痛、抗炎、局部麻醉、抗菌等作用［2-3］，主要成分为挥发油、生物碱、酰胺、黄酮、香豆素、三萜等化合物［4-6］。花椒精油的主要提取方法有有机溶剂萃取法、水蒸气蒸馏法、超临界萃取法等［7-8］，其中水蒸气蒸馏法所得花椒提取物中挥发性物质种类最多［9］，且操作简便，故本研究中采用水蒸气蒸馏法。贵州省德江县万进花椒种植专业合作社创建于2015年，地处德江县东北部稳坪镇，所产青椒粒大饱满、香味浓郁、口感良好，于2020 年被评为国家级花椒示范基地。本研究中采用水蒸气蒸馏法提取该基地所产青椒的精油，采用Box-Behnken 响应面法考察粉碎粒度、料液比、浸泡时间和蒸馏时间对精油得率的影响，优选最佳提取工艺，为贵州省花椒产业的可持续发展提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

QE-500 克摇摆式高速万能粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；DP-500 mL 磨口挥发油提取器（南京康洛达实验科技有限公司）；ZNCL-GS190/90 型智能磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；AL204 型电子天平（梅特勒-托利多＜上海＞有限公司，精度为万分之一）；Thermo Varioskan LUX 型多功能酶标仪（赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司）；101-1AB 型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试药

无水乙醇（分析纯，重庆万盛川东化工有限公司，批号为20201101）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号为20220211）；甲醇（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司，批号为20200611）；青椒样品于2021 年采自贵州省德江县万进花椒种植专业合作社，由贵州医科大学药学院覃容贵教授鉴定为青椒Zanthoxylum schinifoliumSieb.et Zucc.的干燥成熟果皮。

2 方法与结果

2.1 提取方法

取青椒样品30 g，用水蒸气蒸馏法提取精油，并计算得率（%）。精油得率（%）=精油体积（mL）/青椒样品质量（g）×100%。

2.2 单因素试验［10-13］

粉碎粒度：取青椒样品，粉碎粒度分别为原药材（未粉碎，0 目）、20 目、40 目、60 目、80目，分别称取30 g青椒粉，加入料液比1∶25的纯化水，在浸泡时间40 min、提取温度140 ℃、蒸馏时间60 min 工艺条件下提取，每隔15 min 收集精油，记录精油体积。每个粉碎粒度平行试验3次，以确定最佳粉碎粒度。结果见图1 A。可见，当粉碎粒度由原药材到40目时，精油得率明显升高；当由40 目升至60 目时，精油得率升高趋势逐渐平缓；当由60目升至80目时，精油得率只增加了0.06%，升高趋势接近平缓。综合实际，选择60目为最佳粉碎粒度。

料液比：称取粉碎粒度项下粉碎粒度为60目的青椒粉，按料液比分别为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g∶mL）加入纯化水，在提取温度140 ℃、浸泡时间40 min、蒸馏时间60 min 工艺条件下提取，每隔15 min 收集精油，记录精油体积。每个料液比平行试验3次，以确定最佳料液比。结果见图1 B。可见，料液比从1∶10 到1∶20，随着料液比的增加，精油得率逐渐升高，随着料液比的继续增加，精油得率逐渐降低，料液比为1∶20时精油得率最高，故选择1∶20为最佳料液比。

浸泡时间：称取粉碎粒度项下粉碎粒度为60 目的青椒粉，加入料液比为1∶20 的纯化水，分别浸泡0，10，40，70，100 min，140 ℃温度下蒸馏60 min，每隔15 min收集精油，记录精油体积。每个浸泡时间平行试验3次，以确定最佳浸泡时间。结果见图1 C。可见，浸泡时间从0 min到40 min，精油得率逐渐升高，随着浸泡时间的继续增加，精油得率逐渐降低，浸泡40 min 时的精油得率最高，故选择40 min为最佳浸泡时间。

蒸馏时间：称取粉碎粒度项下粉碎粒度为60 目的青椒粉，在浸泡时间40 min、料液比1∶20 和提取温度140 ℃条件下，蒸馏45，120，195，270，345 min，每隔15 min 收集精油，记录精油体积。每个蒸馏时间平行试验3次，以确定最佳蒸馏时间。结果见图1 D。可见，当蒸馏时间从45 min 增加到120 min时，精油得率逐渐升高，随后，精油得率降低并趋于平稳，故选择120 min 为最佳蒸馏时间。

图1 单因素试验结果A.Grinding granule size B.Solid/liquid ratio B.Soaking time D.Distillation time Fig.1 Results of the single factor test

2.3 Box-Behnken 响应面试验［14-16］

试验设计：在2.2项下筛选出的最佳单因素试验条件基础上，采用Box-Behnken 响应面试验设计方案，以影响显著的粉碎粒度（因素A）、料液比（因素B）、浸泡时间（因素C）和蒸馏时间（因素D）4 个因素为自变量，以精油得率为响应值（Y），设计四因素三水平进行Box-Behnken 试验，确定最佳工艺条件。响应面试验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken响应面试验因素与水平Tab.1 Factors and their levels of Box-Behnken response surface test

试验结果：结果见表2。采用Design Expert V8.0.6软件对试验结果进行回归分析，得青椒精油得率对上述4 个影响因素的二次多项回归方程Y=11.57 +0.25A-0.21B-0.21C+0.64D-0.18AB+0.25AC+0.21AD-0.055BC-0.090BD-0.14CD-0.92A2-1.01B2-0.76C2-1.02D2。为验证回归方程的有效性，对青椒精油提取的数学模型进行方差分析，结果见表3。该模型F=18.89，显著性水平P＜0.000 1 ＜0.05，具有显著性。模型的失拟项F=1.03，显著性水平P=0.533 7 ＞0.05，不具有显著性，说明该回归模型与试验数据拟合度良好，未知因素对试验结果干扰小。粉碎粒度（A）、料液比（B）、浸泡时间（C）、蒸馏时间（D）4 个因素对青椒精油得率的影响均显著（P＜0.05），各因素的交互项对青椒精油得率的影响均不显著（P＞0.05），各因素的二次项对青椒精油得率的影响均极显著（P＜0.01）。对精油得率的影响程度为蒸馏时间（D）＞粉碎粒度（A）＞浸泡时间（C）＞料液比（B）。模型的相关系数R2=0.949 7，说明预测值与试验值有较好的相关性，故该模型可用于对青椒精油提取条件的分析与预测。

表2 Box-Behnken响应面试验结果Tab.2 Results of the Box-Behnken response surface test

表3 方差分析结果Tab.3 Results of the ANOVA

结果分析：应用Design-Expert V8.0.6 软件分析试验结果，得青椒精油得率与各因素交互作用的三维响应面图与二维等高线图（图2）。在响应面图中，曲面越陡峭则该因素对青椒精油得率的影响越大［17］。由图2可知，曲面均较平缓，表明这些因素相互作用的影响不明显，与方差分析结果一致（AB，AC，AD，BC，BD，CD 项的P＞0.05）。

2.4 验证试验

通过建立的数学模型预测青椒精油的最佳提取工艺条件为粉碎粒度63.43目、料液比1∶19.35、浸泡时间35.86 min、蒸馏时间146.23 min，在此条件下的精油得率为11.74%。以节流为出发点，结合实际损耗，将预测提取工艺条件修正为粉碎粒度60 目、料液比为1∶20（g∶mL）、浸泡时间36 min、蒸馏时间146 min。按修正后的条件进行3 次验证试验，平均青椒精油得率为11.76%（n=3），与理论值相差0.02%，表明此条件预测性好且较稳定，可用于青椒精油的提取。

3 讨论

目前，青椒精油提取方法的研究热点主要集中在超临界CO2萃取、超声波辅助蒸馏、有机溶剂浸渍提取、微波辅助提取等现代提取工艺方法［18-20］，提取设备要求高，工艺复杂，提取成本较高，不利于工业化大生产，而传统水蒸气蒸馏提取法的设备要求较低，经济适用，操作简单，精油提取率较高，较现代提取方法更适于工业化大生产。响应面法可通过较少的试验设计完成多因素、多水平考察，较正交试验法和均匀设计法更全面，可用于预测试验范围内任何试验点的理论值［21］。本研究中采用Box-Behnken 响应面法优选青椒精油的水蒸气蒸馏提取工艺，为青椒精油的产品研发奠定了试验基础。

采用水蒸气蒸馏法提取精油工艺主要影响因素多为粉碎粒度、料液比、浸泡时间、蒸馏时间，针对青椒精油的水蒸气蒸馏研究基本未考虑粉碎粒度，预试验发现，粉碎粒度对精油得率影响较大，故对粉碎粒度、料液比、浸泡时间、蒸馏时间4个因素进行单因素考察，确定最佳单因素，并以此为基础确定Box-Behnken 响应面试验设计各因素与水平。

A.粉碎粒度-液料比 B.粉碎粒度-浸泡时间 C.粉碎粒度-蒸馏时间 D.液料比-浸泡时间 E.液料比-蒸馏时间 F.浸泡时间-蒸馏时间图2 青椒精油得率与各因素交互作用的三维响应面图与二维等高线图A.Grinding granule size-liquid/solid ratio B.Grinding granule size-soaking time C.Grinding granule size-distillation time D.Liquid/solid ratio-soaking time E.Liquid/solid ratio-distillation time F.Soaking time-distillation timeFig.2 Three-dimensional response surface diagram and two-dimensional contour diagram of the interaction between the yield of volatile oil from Zanthoxylum schinifolium and various factors

经Box-Behnken 响应面试验优化，得贵州产青椒精油最佳提取工艺为粉碎粒度60 目、料液比1∶20（g∶mL）、浸泡时间36 min、蒸馏时间146 min，精油得率为11.76%（n=3）。该优选工艺提取效率较高，且稳定可靠，初步说明贵州省德江县国家级花椒示范基地所产青椒品质较优良。本研究为高值化花椒精油产品的研发和贵州省花椒产业的可持续发展提供了良好的理论依据。