CRISPR/dCas9 系统的研究进展和应用

刘雅睿

（中国海洋大学 海洋生命学院，山东青岛 266003）

基因编辑是研究基因功能的重要方法之一，目前研究人员大多使用人工核酸内切酶（Engineered Endonuclease，EEN）进行基因编辑，常见的EEN包括锌指核酸内切酶（Zinc Finger Endonuclease，ZFN）、类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN）以及CRISPR/Cas（Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated proteins）系统[1]。基于蛋白质-DNA 识别的ZFN、TALEN 定位新位点时需要设计复杂的蛋白质，因此很难应用于高通量技术。与其相比，基于sgRNA 指导的CRISPR/Cas 系统具有多样性、模块化、高效率的特点，且易于设计合成，是基因组编辑及基因表达调控方面的理想工具。

CRISPR/Cas9 系统是存在于许多细菌和大部分古菌中的适应性免疫系统，可以抵御病毒、质粒等外源遗传物质入侵细胞[2]。CRISPR 系统由多样的Cas9蛋白和引导RNA（guide RNA，gRNA）组成。引导RNA 包含两部分，分别是成熟的crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating RNA）。当外源遗传物质（如DNA）入侵生物体时，个体的CRISPR 系统会以外源DNA 的原间隔序列邻近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM）序列为靶点，捕获切割PAM 邻近的外源DNA，并将其作为间隔序列整合到CRISPR的两个重复序列之间，转录后得到pre-crRNA，再经过剪切得到的成熟的crRNA，与tracrRNA 形成双链gRNA 结 构。gRNA 与Cas9 蛋 白 组成 具 有DNA 内切酶活性的复合物，在gRNA 的引导下与外源DNA特异性结合，并使用Cas9 蛋白的核酸结构域对外源DNA 进行切割。

不同生物体内的CRISPR 系统有所不同，可以大致分为I 型、Ⅱ型、Ⅲ型三类。其中酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的Ⅱ型CRISPR 系统由成熟的crRNA、tracrRNA 构成的sgRNA（single guide RNA）及Cas9 蛋白组成。Cas9-sgRNA 复合物与目标DNA 结合后，Cas9 蛋白的HNH、RuvC 结构域分别切割与gRNA 互补的DNA 目标链和非目标链，导致双链断裂。如果Cas9 蛋白的HNH 结构域第840 位由组氨酸突变为丙氨酸，且RuvC 结构域第10 位由天冬氨酸突变为丙氨酸，这两个核酸酶结构域就会处于失活状态，失去剪切DNA 的能力，通常把这种核酸酶失活的Cas9 蛋白称为dCas9（deficient Cas9）蛋白。dCas9 虽然失去了剪切DNA 的能力，但依然能在sgRNA 的引导下与DNA 特异性结合，因此可以用于基因组转录调控、表观遗传学修饰、活细胞成像等领域[3]。本文根据已有报道，总结了CRISPR/dCas9 系统在不同领域的研究进展及应用现状，并对其未来的研究进行展望。

1 dCas9 对基因组转录的调控

dCas9 是依赖RNA 的DNA 结合蛋白，可以不改变目标基因序列，直接对目标基因转录进行修饰及调控。将dCas9 与不同效应物融合进行工程化改造，便可以实现序列特异性基因组调控。典型应用就是CRISPRi（CRISPR interference）和CRISPRa（CRISPR activation）。

CRISPRi 意为CRISPR 干扰技术，可以干扰RNA的转录。在以细菌为代表的原核生物中，dCas9可以通过空间位阻单独阻断RNA 聚合酶（RNA Polymerase，RNAP）的转录延伸，从而阻断转录。QI 等[4]的研究表明，CRISPRi的沉默效应可以被诱导和逆转，且通过全转录组鸟枪法测序发现CRISPRi sgRNA 引导的基因沉默具有高度特异性，没有显著的脱靶效应。而在真核生物中，单一dCas9 的CRISPRi 抑制转录效率较低，为了提高CRISPRi 效果，可以将dCas9 与抑制转录的复合物结合来沉默基因表达。如GILBERT等[5]将dCas9 和抑制转录的Krüppel 相关框（KRAB）结构域融合，可以有效抑制人类细胞转录。

CRISPRa 即通过CRISPR 系统激活或增强转录。BIKARD 等[6]将RNAP 的ω 亚基融合到dCas9的C 端，这个复合物可以定向到启动子区域，有效募集RNAP 以激活基因表达。此外，dCas9 还可以与哺乳动物细胞中的VP64、p65AD 等转录激活因子相结合，激活基因表达。为了提高CRISPRa 的效率，可以同时招募多种转录激活因子来上调基因转录，常见的有协同激活诱导因子（Synergistic Activation Mediator，SAM）、SunTag、VPR（VP64-p65-Rta）系统。（1）KONERMANN 等[7]设计的SAM 系统以sgRNA和dCas9 为支架募集多种协同作用激活因子，在该系统中，dCas9-VP64 与含有两个MS2 RNA 的sgRNA结合，形成的MS2-VP64 可以招募同源蛋白MCP，形成MCP-p65-HSF1 激活结构域。（2）SunTag 是一种重复多肽支架，与dCas9 结合后，抗GCN4 可以招募多个转录激活因子放大基因表达信号。如LIU 等[8]使用dCas9-SunTag-VP64 激活内源性Oct4 和Sox2，触发细胞重编程，诱导产生多功能干细胞。（3）VPR系统则是将VP64-p65-Rta 串联融合后与dCas9 连接，形成三方激活域。CHAVEZ 等[9]的实验发现dCas9-VPR 对内源基因的激活能力远高于dCas9-VP64（22 ～320 倍），且VPR 可通过多基因靶向激活多位点，提高整个基因组的表达水平。

除了可以将单个dCas9 蛋白与转录抑制或激活因子融合，调节某个特异性基因的转录之外，还可以通过支架RNA（scaffold RNA，scRNA）来对同一细胞内的不同基因进行多模式调控。ZALATAN 等[10]将CRISPR/dCas9 的sgRNA 与RNA 适配体相融合，构建scRNA。RNA 适配体可以招募与激活因子或阻遏物融合的RNA 结合蛋白调控转录，通过在每个scRNA 上设计多个RNA 募集位点，便可以独立调整每个靶位点的激活或抑制强度，能同时调节多个基因的转录表达。

2 dCas9 的表观遗传学修饰

表观遗传是指DNA 序列改变之外基因组功能表达发生的可遗传变化，其中以DNA 与组蛋白修饰为代表的染色质编辑是表观遗传学领域的重要部分。dCas9 可以用类似调控靶向基因转录的方式，招募表观遗传修饰域来改变其靶向DNA 位点的表观遗传标记，从而导致相关基因表达的变化。

（1）DNA 甲基化是重要的表观遗传标记之一，其甲基化活性对目标区域具有特异性，并且可以在有丝分裂中遗传。VOJTA 等[11]将dCas9 与DNA 甲基转移酶DNMT3A 结合，其融合蛋白能在以PAM 序列下游27 bp 为中心，约35 bp 宽的区域中靶向CpG 甲基化，且多个gRNA 可以将dCas9-DNMT3A 复合物靶向多个相邻位点，使启动子甲基化水平升高，从而沉默基因表达。（2）而在DNA 去甲基化方面，Tet双加氧酶的催化结构域可以氧化甲基形成5-羟甲基胞嘧啶，然后通过DNA 糖基化酶将其恢复为未修饰胞嘧啶来实现去主动甲基化。如LIU 等[12]构建了dCas9-Tet1 融合蛋白在分裂细胞中有效靶向去甲基化，激活基因表达；XU 等[13]将MS2 RNA 的两个拷贝插入到sgRNA 中，dCas9 与Tet 催化域（Tet-CD）连接，两者融合形成dCas9-Tet1-CD 和MS2-Tet1-CD，可精准实现目标基因的去甲基化和激活，提高转录效率。

组蛋白修饰也是重要的表观遗传标记。组蛋白是DNA 缠绕的线轴，是染色质的主要成分。组蛋白修饰包括赖氨酸或精氨酸甲基化、赖氨酸乙酰化、赖氨酸泛素化或丝氨酸磷酸化等，这些修饰能改变染色质的结构和组织，从而调节基因调控过程。例如组蛋白H3K4 二甲基化和三甲基化以及许多残基上的乙酰化通常与活跃转录的基因有关，而H3K9 和H3K27 二甲基化和三甲基化会压缩染色质使其沉默[14]。THAKORE 等[15]发现dCas9-KRAB 靶向调节珠蛋白基因的H2S 增强子时，会特异性诱导增强子处H3K9me3，使珠蛋白基因表达沉默；KEARNS 等[16]将从脑膜炎双球菌（Neisseria meningitidis）中加工得到的Nm dCas9 与组蛋白去甲基化酶LSD1 连接形成Nm dCas9-LSD1 复合物，靶向作用于小鼠胚胎干细胞的增强子，发现dCas9-LSD1 靶向增强子区域的H3K4me2、H3K27ac 显著下调，有效抑制了由靶向增强子控制的基因表达；而HILTON 等[17]采用另一种方法，将Sp dCas9 和Nm dCas9 与组蛋白乙酰转移酶p300 的催化核心域（p300core）融合，dCas9-p300core 使增强子和启动子的H3K27 乙酰化增加，从而增强转录水平。

3 dCas9 的实际应用

CRISPR/dCas9 系统和其他基因编辑技术一样存在脱靶效应，学者们针对脱靶效应的改善也进行了大量的工作，如GUILINGER 等[18]将dCas9 与FokI核酸酶结构域融合，尝试降低其脱靶效应。虽然CRISPR/dCas9 系统仍有缺点，但它引入可逆DNA 表观遗传修饰，调控多个基因靶向表达的特性已经在基因组成像、植物研究及癌症治疗方面得到了实际应用。

3.1 dCas9 在基因组成像领域的应用

染色质的时空组织和动力学在调节基因组功能中起关键作用。目前细胞成像主要依赖于荧光标记的DNA 结合蛋白，常见的荧光原位杂交技术（Fluorescent in Situ Hybridization，FISH）虽然能通过改变核酸探针的碱基序列来与不同目标序列匹配，但样本固定和DNA 变性使FISH 不能实时成像。而CRISPR 系统既有核酸探针的灵活性，又具有能与DNA 结合的蛋白，因此CRISPR 系统是核细胞动态成像的理想工具。

CHEN 等[19]首次利用CRISPR 系统构建了活细胞成像系统，该系统由增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）、dCas9 及结构优化的sgRNA 构成。研究人员对sgRNA 进行了AU 碱基对翻转，以去除Pol-Ⅲ终止子，防止转录过早终止，还扩展了结合dCas9 的发卡结构，这些改造提高了成像效率。该成像系统能可视化重复或非重复的基因组序列，报告端粒的长度变化和运动，还可以检测整个细胞周期基因位点的动态。TANENBAUM 等[20]使用SunTag 招募多达24 个绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）拷贝，可以对活细胞的单个蛋白质分子进行长期成像。DENG 等[21]发现体外组装的荧光dCas9-sgRNA 复合物可以有效且特异性地在近着丝粒区、着丝粒、G 富集端粒和编码基因位点附近标记DNA 靶序列，他们将这种方法命名为CASFISH （Cas9-mediated Fluorescence in Situ Hybridization），即Cas9 介导的荧光原位杂交。研究证实，CASFISH 可用于具有多种颜色的多个序列特异性基因组区域成像，且这些多重标记较为稳定；学者们还制备了成年小鼠大脑的低温恒温器切片，并对着丝粒和端粒进行了CASFISH 测定，表明固定的细胞和组织也可以通过体外组装的荧光标记的dCas9-sgRNA 复合物进行有效标记。WANG 等[22]报道了一种称为CRISPR 活细胞荧光原位杂交（CRISPR Live-cell Fluorescent in Situ Hybridization，CRISPR LiveFISH）的实时成像方法：CRISPR LiveFISH 将dCas9 和荧光标记的sgRNA 在体外组成荧光核糖核蛋白（fRNP），通过电穿孔将fRNP 复合物导入活细胞中，随后与DNA 靶序列结合。CRISPR LiveFISH与活细胞兼容，可以跟踪基因组编辑、染色体易位和转录的实时动态，且dCas9-gRNA-DNA 复合物十分稳定、不易降解，提高了信噪比，可用于诊断染色体疾病。

3.2 dCas9 在植物研究中的应用

CRISPR/dCas9 系统在植物中的研究应用以转录调控为主。在植物的生长过程中，增强对外界的胁迫耐受性十分重要，而植物的耐受性又受到体内复杂的调控网络，包括代谢、信号传导和转录调控之间的多方面相互作用[23]。因此，使用CRISPR/dCas9 调控部分目标基因的转录可能有利于增强作物的胁迫抗性，从而提高其产量和经济价值。例如PARK 等[24]使用dCas9-VP16-p65 激活目标基因AVP1 转录，使拟南芥积累更多的K+、Na+，提高了植物对干旱胁迫的耐受性。

除了通用的调控转录方法，CRISPR/dCas9 系统还可以与植物转录效应子结合，特异性地调控转录。植物特异性转录调节因子包含了植物独有的、高效的转录调控序列，在调节复杂的生物过程中起着核心作用。例如乙烯响应因子/乙烯响应元件结合蛋白（ERF/EREBP）家族包含的强激活结构域EDLL 和阻遏结构域SRDX，可以与dCas9 融合激活或抑制基因表达[25]。MORADPOUR 等[26]概述了目前促进植物中CRISPR 转录激活的3 种策略：（1）将各种激活剂与dCas9 串联，较常用的转录激活结构域包括dCas9-VP64、dCas9-EDLL 以及将两者结合的dCas9-VP64-EDLL；（2）使用修饰的gRNA 支架来招募转录激活因子，多采用MS2 适配体插入sgRNA 的茎环形成新的gRNA 支架，构建更强的转录激活系统；（3）使用多路转录激活系统来同步激活植物中的多个基因，如LOWDER 等[27]开发的高激活效率CRISPR-Act2.0 系统，可以上调单子叶植物和双子叶植物中的多个基因表达。

在抑制植物转录方面，以dCas9 结合阻遏结构域SRDX 为主，目前已经报告了拟南芥中和本塞姆氏烟草中利用dCas9-3xSRDX 抑制转录的实例[28-29]。

3.3 dCas9 在癌症治疗中的应用

癌症是一种以癌基因和肿瘤抑制基因的多种遗传和表观遗传改变为特征的疾病。近年来，癌症治疗策略已经从手术转向有针对性的精准医疗。除了遗传异常外，表观遗传失调是癌症的共同特征，其中，异常的DNA 甲基化和可逆的组蛋白修饰是与癌症关联最明显的表观遗传改变，参与肿瘤的发生、分化和转移[30]。CRISPR/dCas9 作为一种能定向进行表观遗传编辑的分子工具，可以逆转表观遗传学修饰，在抗癌治疗中颇有前景。用于表观遗传编辑的表观遗传效应子大致分为组蛋白和DNA 修饰剂，其酶促反应可以催化转录激活或抑制组蛋白/DNA 修饰。表观遗传编辑的第一种策略是仅使用催化结构域来构建表观遗传效应电路，以避免酶的共价变构调节问题；第二种策略是在真核系统中利用原核DNA 甲基转移酶进行修饰[31]。

治疗性sgRNA-dCas9 首先应用于体外细胞系。RAHMAN 等[32]总结了dCas9 对癌症的体外作用：dCas9 通过与表观遗传效应子融合形成sgRNAdCAS9-EE，靶向乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌和子宫内膜癌癌细胞的原癌基因（GRN、FHL2、CNKSR1）或抑癌基因（PTEN、BRCA1、CDKN2A、RASSF1、HIC1等），抑制肿瘤的侵袭和迁移。另一方面，CRISPR 系统的内在机制决定了它只能在其靶细胞内部发挥作用，可以通过物理方法、以腺病毒为代表的病毒载体或合成脂质、聚合物和无机颗粒等非病毒载体这三种方法将sgRNA-dCas9 系统递送到体内。CRISPR/dCas9 的癌症体内治疗中可分为三阶段[33]：第一阶段，药物在血液循环过程中保持稳定；第二阶段，药物在肿瘤组织中积累；第三阶段，药物进入癌细胞，从核内体逸散到细胞质，最后进入细胞核调节目标基因。同时，CRISPR/dCas9 与转录效应物融合后，可以与癌症治疗药物联合发挥作用，这些药物的作用机制是调节癌基因和肿瘤抑制基因的表达或使多重耐药基因失活[34]。两者的协同作用或互补性可以增强治疗效果。

4 结语

本文介绍了CRISPR/dCas9 系统的作用机制，总结了近年来CRISPR/dCas9 系统在基因组调控、表观遗传学修饰，以及其在基因组成像、植物研究、癌症治疗方面的实际应用。随着修饰工具的优化与开发，CRISPR/dCas9 在不同领域得到了更广泛的应用。但CRISPR/dCas9 技术仍面领着挑战，实际操作中依旧存在脱靶效应、sgRNA 设计、目标位点选择和sgRNAdCas9 递送系统方面的难题。随着科学家对CRISPR系统原理的理解不断深入，CRISPR/dCas9 技术会更为成熟，并在更多的领域中得到应用。