槲皮素对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞AKT/mTOR信号通路及自噬的影响

宋 涛，官泽宇，徐 超，朱二畅，蔡 瑶，卢 冉，余朝文

血管内皮细胞在维持心血管系统的正常生理功能发挥重要作用，它通过分泌一系列血管活性物质调节血液的自分泌、内分泌或旁分泌，改善血流、血管壁张力、血管生成和炎症。由于其屏障功能，血管内皮细胞更容易受到物理或化学危险因素诱导的损伤[1]，因此血管内皮细胞损伤发生在许多临床事件中，包括血管生成、动脉粥样硬化、血栓形成、高血压和心力衰竭[2]。

自噬可以消除不必要或功能失调的细胞器和细胞。众所周知，伴随轻链 3 Ⅰ/Ⅱ (LC3 Ⅰ/Ⅱ)和Beclin 1变化的自噬功能障碍与许多疾病的发病机制有关。LC3 Ⅱ是LC3的脂化形式，已被证明是哺乳动物的自噬体标志物，并已应用于研究多种炎症条件下的自噬[3]。 Beclin 1是自噬体成核复合物的关键成分，可促进LC3转化和 LC3 斑点的形成。自噬被破坏，通常会发生LC3 Ⅱ和Beclin 1 的表达降低[4]。一些证据表明，血管内皮细胞的自噬功能障碍导致内皮功能障碍和血管稳态破坏，进一步导致心血管疾病的发病机制[5]。此外，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 是细胞代谢的主要调节因子，是调节自噬的关键分子[6]。

槲皮素是一种黄酮类化合物，主要存在于中药材。研究[7]表明，槲皮素具有抗氧化、抗癌和抗炎特性，重要的是，槲皮素已被证明可以保护人脐静脉内皮细胞(HUVECs)过氧化氢引起的损伤。而且槲皮素已被证实可在高糖水平可以介导部分细胞系自噬[8]，且氧化应激损伤的线粒体、细胞可通过机体内的自噬降解提高抗氧化能力，增强细胞活力。因此，槲皮素有可能通过介导自噬来防止内皮细胞损伤。本研究主要分析了槲皮素是否可以保护 HUVECs 免受过氧化氢诱导的损伤并识别可能涉及的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试药及仪器 HUVEC(编号7-1074)购自齐氏生物科技有限公司。槲皮素(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：180704)；兔抗人LC3 Ⅰ/Ⅱ(批号：ABC929)、AKT(批号：SAB4500797)、mTOR(批号：T2949)、β-actin(批号：A3653)抗体、HRP标记的羊抗兔IgG二抗(美国，Sigma公司)。 CBl50 CO2细胞培养箱(德国Binder公司)；酶标仪(美国，BioTek)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HUVEC在RPMI-1640培养基中培养，辅以10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素，采用5% CO2在37 ℃培养箱中孵育，并进行细胞传代。

1.2.2 分组、建模和给药 HUVEC以8×103个细胞/孔的密度接种在 96孔板中。细胞贴壁后，分为对照组(RPMI-1640 培养基)，H2O2组(200 μmol/L H2O2)，阳性对照组(200 μmol/L H2O2+50 μg/mL 维生素 E)，槲皮素组 (200 μmol/L H2O2+30、15、7.5 μmol/L槲皮素)。

1.2.3 MTT检测 HUVEC 以 8×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中。 细胞贴壁后，依据实验分组给药，48 h后将 MTT(20 μL 0.5 mg/μL PBS溶液)加入每个孔中，并将板置于37 ℃下孵育4 h。然后介质去除并在每个孔中加入 DMSO(150 μL)，维持10 min以溶解紫色甲臜晶体。使用酶标仪570 μm 处测定吸光度。基于以下公式计算细胞活力的百分比：细胞活力(%)=A570给药组/A570对照组×100%。

1.2.4 MDC染色 MDC 染色用作自噬囊泡的示踪剂，阳性细胞在其核区周围着色，所有酸性液泡被染色。对数生长期的细胞接种在24孔板中，设置对照组(RPMI-1640 培养基)，H2O2组(200 μmol/L H2O2)，槲皮素组 (200 μmol/L H2O2+30、15、7.5 μmol/L槲皮素)，培养48 h制作细胞爬片，细胞爬升片制备过夜进行组处理，37 ℃水浴中加入0.05 mmol/L MDC处理 15 min，用 PBS 洗涤 3 次，然后用 4% 多聚甲醛固定 15 min。 然后在抗荧光淬灭载玻片上进行荧光显微镜避光观察。

1.2.5 Western blotting实验 对数生长期的细胞接种在6孔板中，设置对照组(RPMI-1640 培养基)，H2O2组(200 μmol/L H2O2)，槲皮素组 (200 μmol/L H2O2+30、15、7.5 μmol/L槲皮素)，培养48 h。将细胞在含有1 mmol/L PMSF的 RIPA缓冲液裂解。收集上清液并通过BCA蛋白质测定试剂盒检测蛋白质浓度。在8%～15%梯度SDS-PAGE凝胶上加载和分离蛋白质，然后转移到PVDF膜。用脱脂牛奶封闭非特异性结合位点1 h后，将膜与LC3B(1∶1 000)、p-AKT(1∶2 000)、AKT(1∶2 000)、p-mTOR(1∶2 000)、mTOR(1∶2 000)、β-actin(1∶1 000)一抗一起孵育过夜。然后将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下以1∶5 000 稀释度孵育1 h。条带通过WD-9413B成像系统检测，ImageJ 软件(1.51a 版)用于分析条带密度。

1.2.6 3-MA对槲皮素诱导自噬的影响 实验设置对照组、H2O2组(200 μmol/L H2O2)，槲皮素组 (200 μmol/L H2O2+30 μmol/L槲皮素)，槲皮素(200 μmol/L H2O2+30 μmol/L槲皮素)+3-MA(10 mmol/L 3-MA)组，处理48 h，每孔添加20 μL MTT，孵育 4 h。570 nm测量光密度，Western blotting检测相关蛋白水平。

1.3 统计学方法 采用单因素方差分析和LSD-t检验。

2 结果

2.1 槲皮素对细胞活力的影响 与对照组比较，H2O2组细胞吸光度值明显降低(P<0.01),提示模型建立成功。与H2O2组比较，阳性对照组、30、15、7.5 μmol/L槲皮素组吸光度值明显增加(P<0.01)(见表1)。

2.2 槲皮素对细胞中自噬体的影响 与H2O2组比较，槲皮素能增加HUVEC中MDC染色标记的荧光颗粒，并伴随槲皮素浓度的上调明显增加(P<0.01)(见图1、表2)。

2.3 槲皮素对自噬相关蛋白的影响 槲皮素能促进HUVEC中自噬蛋白LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ水平表达(P<0.01)，降低p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平(P<0.01)(见图2、表3)。

2.4 3-MA对槲皮素诱导自噬的影响 与对照组比较，H2O2组LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ明显降低(P<0.01)，p-mTOR/mTOR明显增加(P<0.01)，细胞活力明显下调(P<0.01)；与槲皮素组比较，槲皮素+3-MA组LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ明显降低(P<0.05)，p-mTOR/mTOR明显增加(P<0.05)，细胞活力明显降低(P<0.05)(见图3、表4)。

表1 槲皮素对细胞活力的影响(ni=3)

表2 各组HUVEC细胞MDC相对荧光强度

表3 槲皮素对自噬相关蛋白的影响

3 讨论

氧化应激被认为是一种高血糖条件下血管内皮细胞损伤的主要因素。文献[9]显示，槲皮素可被视为抗氧化剂。目前的研究显示，槲皮素可以改善 HUVECs 暴露于高浓度葡萄糖后的抗氧化防御系统。例如用槲皮素处理后，用 30 mmol/L 葡萄糖处理的HUVECs细胞的丙二醛和活性氧自由基显着降低[10]。因此，槲皮素对调节氧化剂/抗氧化剂失衡，减少氧化剂对血管内皮损伤具有一定的功能，即通过抗氧化剂清除氧自由基，减少氧化损伤和随后的细胞死亡，并可以通过自噬清除损伤的线粒体、细胞，提高细胞活力。在本研究中，7.5、15、30 μmol/L槲皮素能有效地提高HUVECs细胞活力，这也证实了上述的观点。并且30 μmol/L槲皮素处理HUVECs后，细胞活力达到了74.17%，因此后续验证槲皮素调控自噬的机制时，选择了该浓度进行了相关实验。

表4 3-MA对槲皮素诱导自噬的影响

槲皮素对H2O2引起的细胞损伤的有效抗氧化能力机制比较复杂，其中自噬作为一种分解代谢过程，能消除受损细胞器，在细胞稳态中发挥着至关重要的作用。自噬受自噬相关基因编码的一些特殊蛋白质的严格调控相关程序[10]。在这些蛋白质中，LC3 对于自噬体的生物发生或成熟是必不可少的，它还可作为选择性自噬的衔接蛋白发挥作用。根据多种文献，LC3 Ⅰ被转化为LC3 Ⅱ，这是自噬早期的一个众所周知的标志物[12]。而AKT/mTOR信号通路是负性调控自噬的经典途径，活化AKT使 AKT 发生磷酸化，之后将信号传至mTOR，触发mTOR磷酸化，从而激活AKT/mTOR信号通路,mTOR通过影响自噬体的形成，对自噬起负调控作用。本研究中，槲皮素会抑制HUVECs细胞中的AKT/mTOR信号传导，诱导自噬体形成和LC3 Ⅱ 的上调。自噬阻断 (3-MA) 可有效缓解槲皮素对自噬的影响，表明自噬激活有助于槲皮素促进细胞增殖。而且自噬阻断，还会进一步影响AKT/mTOR信号通路的分子水平，自噬抑制剂 3-MA和30 μmol/L槲皮素共同处理HUVECs细胞，LC3 Ⅱ表达水平较30 μmol/L槲皮素组明显减弱，mTOR磷酸化水平明显加强，而mTOR磷酸化水平受到p-AKT的调控，这些发现进一步表明 AKT/mTOR信号通路参与了 HUVECs细胞自噬，并调控细胞增殖。

总之，槲皮素可通过抑制 AKT/mTOR信号诱导细胞自噬并促进 HUVECs细胞增殖。这些数据阐明了槲皮素改善血管内皮功能的潜在机制，并表明其作为静脉内皮细胞自噬诱导剂的潜在治疗价值。