CDK1和CCNB1表达水平在肝细胞癌中的临床意义

朱文文，肖葛琼

(绍兴文理学院附属医院 肿瘤内科，浙江 绍兴 312000)

原发性肝癌是癌症致死的第2大原因，其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占90%以上[1]。HCC是全球第5大最常见的癌症类型，并且其发病率呈逐年升高趋势[2]。许多HCC患者到了疾病晚期才被确诊，错过了手术和治疗的最佳时机，并且 HCC患者的五年生存率并不理想[3]。因此实现HCC的早期诊断是临床研究的重点之一。

既往研究挖掘了和HCC组织恶性发展相关的潜在关键基因，包括细胞周期蛋白B1(cell cycle-related proteins cyclin B1, CCNB1)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase 1,CDK1)[4-5]。CCNB1、CDK1在HCC中具有潜在的应用价值[6-8]，但目前相关的临床研究还比较少。本研究分别从诊断、预后以及与临床病理分期的相关性上，分析CDK1和CCNB1表达水平在HCC中的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年6月—2015年6月绍兴文理学院附属医院肿瘤科收治的HCC患者112例。男性72例、女性40例，60岁以上39例、60岁及以下73例；病理分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期37例，Ⅲ期54例，Ⅳ期12例。纳入标准：①经影像学和术后病理学检查确诊为HCC；②术前未接受过放化疗；③临床资料完整；④对本研究知情同意。排除标准：①转移性肝癌；②严重心、肺、肾等器官功能不全；③合并其他恶性肿瘤；④合并免疫性疾病；⑤合并血液系统疾病。在患者手术过程中获取其HCC组织以及配对的癌旁正常组织。本研究已获得本院伦理委员会批准。

1.2 实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测CDK1与CCNB1的相对表达量 通过Trizol试剂(Invitrogen，USA)从组织中提取总RNA，然后使用Superscript Ⅱ试剂盒(Invitrogen，USA)进行反转录。使用DBIBestar©SybrGreen qPCR试剂盒，通过实时PCR(Stratagene Mx3000P)对mRNA的水平进行定量。在SYBR Green Supermix(Bio-Rad，USA)和ABI Prism 7700系统(Applied Biosystems，USA)构建下进行PCR。一式3份分析样品，并用2-ΔΔCt方法分析。GAPDH用于内部对照。引物设计见表1。

表1 引物序列表

1.3 随访 手术后对患者进行为期5年的随访，随访截止时间为2020年6月。记录患者的无进展生存期(progression-free survival, PFS)和总生存期(overall survival, OS)。随访期间无病例脱落。

1.4 统计学方法 应用SPSS和GraphPad Prism进行统计分析。2组间计数资料比较采用t检验，诊断价值通过ROC曲线进行分析，通过Pearson线性和Spearman秩相关性分析分别评估正态资料和等级资料的相关性，log-rank test和Gehan-Breslow-Wilcoxon test对生存曲线进行差异分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC组织中CDK1和CCNB1的表达水平 qRT-PCR检测结果显示，HCC患者癌组织中的CDK1、CCNB1表达水平均高于配对的癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

A.正常组织和HCC组织中CDK1的表达水平；B.正常组织和HCC组织中 CCNB1的表达水平；** P<0.01。

2.2 HCC组织中CDK1和CCNB1二者间及与HCC病理分期的相关性 Pearson相关性分析结果表明，HCC组织中CDK1和CCNB1的表达水平显著正相关(r=0.769，P<0.01)，见图2 A。Spearman相关性分析结果显示，CDK1和CCNB1的表达水平均与HCC病理分期显著正相关(r=0.828、0.726，均P<0.01)，见图2 B、2 C。

A. CDK1与CCNB1表达水平的相关性；B. CDK1表达水平和病理分期相关性；C. CCNB1表达水平和病理分期相关性。

2.3 CDK1、CCNB1在HCC中的诊断价值 将癌旁正常组织中CDK1和CCNB1的表达水平作为对照组，进行ROC分析，结果显示：CDK1诊断HCC的AUC为0.817，敏感度和特异性分别为87.5%、71.4%，cut-off值为1.377；CCNB1诊断HCC的AUC为0.810，敏感度和特异性分别为92.0%、64.3%，cut-off值为1.395；CDK1和CCNB1联合诊断HCC的AUC为0.837，敏感度和特异性分别为83.0%、77.7%。见图3。

A.单独诊断HCC；B.联合诊断HCC。

2.4 CDK1与CCNB1在HCC中的预后价值 分别以HCC癌组织中CDK1、CCNB1表达的中位值，将患者分为CDK1高表达组、CDK1低表达组、CCNB1高表达组以及CCNB1低表达组，随访5年，统计患者的PFS和OS。结果表明， CDK1和CCNB1高表达的HCC患者的PFS和OS均短于低表达者，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

图4 CDK1(A、B)与CCNB1(C、D)不同表达水平的HCC患者生存分析曲线

3 讨论

尽管关于HCC的外科手术技术、综合治疗和针对性疗法都在不断发展，但目前HCC患者的总生存率仍然不理想[9]。因此实现HCC的早期诊断是临床研究的重点之一。目前甲胎蛋白(AFP)是临床上用于诊断HCC最常用的一项肿瘤标志物，但其诊断的敏感度不够理想，存在一定的局限性[10]。CDK1是一种重要的周期调节蛋白，也是CDK家族中唯一可以独立调节细胞周期的蛋白[11]。已有研究报道表明，二甲双胍通过上调miR-378和下调CDK1来发挥对HCC的抑制能力[6]，而上调CDK1基因的表达能够促进HCC的发生和恶性发展[12]。此外，CCNB1和CCNB2可以与CDK1形成复合物，进而参与调控细胞周期过程[7]。Gu等[8]的研究报道通过裸鼠成瘤实验验证了miR-144负调节CCNB1并抑制瘤体生长。因此，本研究希望通过探究CDK1和CCNB1在HCC中临床价值，进而发现全新的生物标志物。

之前的研究表明，CDK1和CCNB1在横纹肌肉瘤中均显著高表达，且其高表达有一定的临床诊断价值[13]，与本研究结果一致。这种表达失调是否具有诊断价值目前也尚未发现相关临床文献，在本研究中我们通过ROC分析得知CDK1和CCNB1表达水平均具有较好的临床诊断价值，CDK1的诊断价值和特异性要优于CCNB1，且二者联合诊断更进一步提升了诊断价值和诊断的特异性。相关文献[14-16]表明，CDK1和CCNB1的表达水平二者间存在很高的相关性，并且分别和不同肿瘤的临床病理特征存在一定的相关性。本研究中， HCC患者的癌组织中CDK1和CCNB1的表达水平显著正相关，CDK1表达水平、CCNB1表达水平均和HCC病理分期显著正相关，其中CDK1和HCC病理分期的相关性更高一些。相比于CCNB1，CDK1在独立诊断和病理分期相关性分析上均具备一定的优势。

Zhu等[17]发现CDK1高表达促进5-氟尿嘧啶耐药的结直肠癌细胞的恶性进展，且与结直肠癌患者的预后不良相关。也有报道[18-19]表明，CCNB1在乳腺癌和胃癌中是潜在的预后标志物。在本研究中，我们发现CDK1、CCNB1低表达组HCC患者的无进展生存期和总生存期均显著长于CDK1、CCNB1高表达组。可见，CDK1、CCNB1的低表达与HCC患者较好的预后显著相关，CDK1和CCNB1对HCC患者的预后评估有一定价值。

综上所述，本研究发现CDK1和CCNB1在HCC中具有较高的诊断价值和预后价值，与病理分期呈显著正相关，两者都具备较高的临床价值。此外本研究还发现HCC患者组织中的CDK1和CCNB1表达水平间存在相关性，表明两者之间或许存在调控关系，在今后的研究中可就此进行深入探究。