CaCl2电解水处理提高绿豆芽品质及其机理

张馨丹，李 翠，薛文通，刘海杰*

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

绿豆富含多种营养活性物质，包括蛋白质、碳水化合物、脂类、氨基酸、酚类、矿质元素等[1]。绿豆发芽后得到绿豆芽，大量研究已经证明绿豆经过萌发后，其VC、酚类物质、膳食纤维、γ-氨基丁酸、矿质元素等的含量大幅度提高，同时植酸、蛋白酶抑制剂等抗营养物质含量明显降低[2-4]。我国绿豆芽消费需求量巨大，据估算，每人年消费芽菜18.25 kg（每人每天 50 g），按全国14亿人口计，芽菜年需求量达2 555万 t[5]。然而，由于其含水量高，质地脆弱极易受到损伤而引起品质劣变，从而影响货架期。在常温下一般只可保存1～2 d，在低温冷藏条件下也只有3～5 d，生产和销售受到一定制约[6]。

电解水是在电解槽中通过电解含有稀盐酸（HCl）或食盐（NaCl）的溶液而得到的，在食品工业中得到了广泛的应用[7]。其不仅可以实现对果蔬的消毒杀菌[8]、促进活性成分积累[9]，同时大量的研究表明电解水可以通过抑制褐变、降低呼吸强度和乙烯产生、抑制细胞壁降解、清除活性氧积累等实现对果蔬的采后保鲜[10]。钙作为植物生长重要的信号分子和调节物质，其可以维持细胞膜的完整性，增强细胞壁的结构及与细胞间的黏结作用，调节体内各种酶的代谢过程及活性等达到延缓衰老、维持果蔬品质的目的[11]，其中氯化钙（CaCl2）是果蔬保鲜常用的钙盐。绿豆芽不仅保鲜期短，同时已被确定为食源性疾病发生的一个重要风险因素[12]，因此需要采取一定的处理手段来延长货架期、提高食用安全性。目前关于CaCl2电解水（CaCl2electrolyzed water，CEW）应用的相关报道还比较少。因此，本研究探讨CEW处理对绿豆芽采收后贮藏期间品质的影响，并对作用机理进行探讨，旨在为绿豆芽的贮藏保鲜提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验所用的绿豆品种‘草原巨峰’绿豆购自北京市海淀区圣熙8号美廉美超市。

三氯乙酸、硫代巴比妥酸、碘化钾、邻苯二酚、硼酸、四硼酸钠、无水碳酸钠 上海麦克林生化科技有限公司；无水碳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠国药集团化学试剂有限公司；福林-酚、亚硝酸钠、氯化铝、愈创木酚、L-苯丙氨酸、交联聚乙烯吡咯烷酮、TritonX-100 北京索莱宝科技有限公司。所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WS150III恒温恒湿培养箱 上海树立仪器仪表有限公司；电解水生成器 实验室自制；RC-3F有效氯测定仪 日本笠原理化工业株式会社；pH测定仪上海佑科仪器仪表有限公司公司；UV-1600紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；CT3质构仪 Brookfield（中国）有限公司；低场核磁共振成像仪 上海纽迈电子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 绿豆芽生产与贮藏

CEW制备：首先配制25 mmol/L的CaCl2溶液，在电解之前用浓盐酸调节pH值为4.4±0.05，之后倒入无隔膜电解槽中，接通电源，以恒定电流3.0 A电解，通过调节电解时间，控制电解水有效氯浓度为10 mg/L（用有效氯测定仪测定）。之后再次用浓盐酸调节pH值至5.50±0.05，得到CaCl2电解水，记作25CaE10。

绿豆萌发：挑选籽粒饱满、无虫害的绿豆种子，自来水冲洗干净，用5 倍籽粒体积的CEW于室温黑暗条件下浸种5 h，自来水组作为对照。浸种完毕后，将种子单层平铺于覆有纱布的发芽盒中，置于25 ℃、相对湿度85%的恒温恒湿培养箱黑暗培养，期间每天喷淋3 次保持种子湿润，具体流程如图1所示。4 d后收获豆芽，沥干表面水分，装入保鲜袋中4 ℃低温贮藏，并于贮藏第0、1、3、5天取绿豆芽鲜样测定采后各生理指标。

图1 CEW处理生产绿豆芽示意图Fig.1 Schematic diagram of the application of CEW processing to produce mung bean sprouts

1.3.2 绿豆芽指标测定

1.3.2.1 绿豆芽质量损失率的测定

在贮藏前测定每份绿豆芽的质量，在贮藏过程中取样时再次测定每份绿豆芽的质量。结果取3 次测量的平均值。质量损失率计算公式如下。

1.3.2.2 绿豆芽相对电导率的测定

参照Wang Lei等[13]的方法测定，采用简易浸泡法。

1.3.2.3 绿豆芽硬度、脆度的测定

采用CT3质构仪测定绿豆芽下胚轴的硬度及脆度，利用标准探头TA44（4 mm DIAM、35 mm LONG）进行50%形变压缩实验。探头速率为0.5 mm/s，触发点负载6.8 g。测定部位为距下胚轴基部2 cm处。

1.3.2.4 绿豆芽菌落总数的测定

参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[14]测定绿豆芽菌落总数。

1.3.2.5 绿豆芽丙二醛、过氧化氢含量的测定

采用硫代巴比妥酸法[15]测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；采用碘化钾法[15]测定过氧化氢（H2O2）含量。

1.3.2.6 绿豆芽总酚含量的测定

采用福林-酚法[16]测定总酚含量，结果以每克样品所含没食子酸质量计，单位为mg/gmf。

1.3.2.7 绿豆芽褐变指数的测定

参照Sikora等[17]的方法测定绿豆芽褐变指数。取绿豆芽鲜样，黑暗放置5 min，充分吸净表面水分。取下胚轴中段2 g，加入8 mL蒸馏水，冰浴研磨成匀浆，4 ℃、6 000 r/min离心15 min后取上清测定波长420 nm下的吸光度，最终以10×OD420nm表示褐变指数。

1.3.2.8 绿豆芽水分状态的测定

利用低场核磁共振仪分析软件中的FID脉冲序列寻找磁场的中心频率及硬脉冲宽，利用硬脉冲回波序列CPMG采集不同贮藏时间绿豆芽的横向弛豫时间T2图谱。测定参数为：时间点数据722 434、射频延时0.08 ms、模拟增益20 db、重复采样等待时间5 000 ms、回波时间0.3 ms、回波个数1 2000和重复采样次数16。将采集生成的自旋回波信号导入核磁共振反演拟合软件各自反演，反演方法为SIRT。

1.3.2.9 绿豆芽褐变相关酶活力的测定

采用邻苯二酚法[18]测定多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力；采用愈创木酚法[15]测定过氧化物酶（peroxidase，POD）活力；参照张礼良等[19]的方法测定苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）活力。

1.4 数据处理与分析

所有实验均进行3 次重复，数据表示为平均值±标准差，利用Excel软件分析数据，SPSS 26软件进行单因素方差分析，利用Duncan多重比较分析数据显著性差异，显著水平为P＜0.05，使用Origin和Excel软件制图。

2 结果与分析

2.1 贮藏过程中绿豆芽质量损失率、相对电导率以及代谢物MDA、H2O2含量的变化

从图2可以看出，在贮藏过程中，自来水对照组和25CaE10处理组绿豆芽的质量损失率、相对电导率、MDA以及H2O2含量变化趋势一致，均表现为逐渐增加，除了贮藏1 d时的质量损失率，25CaE10处理组的其余相关指标数值始终低于对照组。在贮藏1 d时，绿豆芽均还处于较新鲜的状态，失水较少，细胞膜较完整，H2O2还未开始积累，氧化损伤较轻；贮藏3 d时，质量损失率、相对电导率、MDA含量以及H2O2含量均有所提高，其中，质量损失率有较为明显的提高，但处理组与对照组之间不存在显著差异（P＞0.05）；贮藏5 d时，对照组与处理组的各指标数值进一步增加，其中，对照组的质量损失率由8.59%升高到20.66%，增加约1.41 倍，水分流失严重，而25CaE10处理组质量损失率（10.36%）明显低于自来水对照组，降低了约49.9%，并且存在显著差异（P＜0.05）；而贮藏5 d时对照组、25CaE10处理组的相对电导率分别为26.64%、22.24%，降低约16.5%；同时，25CaE10处理组的MDA、H2O2含量分别为2.243 nmol/gmf、192.176 nmol/gmf，相比对照组分别降低约27.5%、36.8%。说明CEW处理一定程度上抑制了绿豆芽的蒸腾失水，维持了绿豆芽细胞膜的完整性，减少内容物的流失，抑制MDA、H2O2含量的升高，减少积累，延缓细胞膜脂过氧化的速度。

图2 CEW处理对绿豆芽贮藏过程中质量损失率（A）、相对电导率（B）、MDA含量（C）、H2O2含量（D）的影响Fig.2 Effects of CEW treatment on mass loss percentage (A),relative conductivity (B),MDA content (C) and H2O2 content (D) of mung bean sprouts during storage

2.2 CEW处理对绿豆芽采后低温贮藏水分状态的影响

水分的自由度随T2弛豫时间的变化而不同，T2越短说明水分和物质的结合程度越高，反之越低。从图3可以看出，绿豆芽的T2图谱大致有4 个峰，分别代表不同状态水分的分布情况，根据弛豫时间T2，将其划分为结合水（T210.1～10 ms）、不易流动水（T2210～100 ms）、自由水（T23100～1 000 ms）3 种，水分状态与王娟等[20]关于灵武长枣的检测结果基本一致。以峰面积A21表示结合水含量，A22表示不易流动水含量，A23表示自由水含量，三者之和A表示总水分含量，结果如表1所示。

图3 绿豆芽贮藏3 d时的横向弛豫时间（T2）图谱Fig.3 Transverse relaxation time (T2) spectra of mung bean sprouts stored for three days

表1 绿豆芽贮藏过程中不同状态水的峰面积变化Table 1 Changes in the peak area of water in different states in mung bean sprouts during storage

从表1可以看出，绿豆芽中的水分主要以自由水的形态存在，其次是不易流动水，结合水含量最少。在贮藏过程中，对照组与25CaE10处理组绿豆芽的总水分含量A和不易流动水含量A22、自由水含量A23变化趋势相同，均表现为不断降低，说明贮藏期间绿豆芽水分不断流失，其中不易流动水、自由水散失严重；结合水含量A21基本保持稳定，不易散失。此外，在贮藏1、3、5 d时，25CaE10处理组的总水分含量A和自由水含量A23均显著低于对照组（P＜0.05），不易流动水含量A22和结合水含量A21略高于对照组，差异不显著（P＞0.05），说明CEW处理因为钙离子的引入，一定程度上对水分状态产生影响。同时，进一步分析实验数据发现25CaE10处理组总水分含量下降速率较慢，推测较好的保水性可能也是其贮藏效果最佳的原因之一。

2.3 CEW处理对绿豆芽贮藏期间质构特性的影响

从图4可以看出，在贮藏过程中，对照组和25CaE10处理组绿豆芽的硬度、脆度均表现为逐渐降低的趋势，25CaE10处理组的硬度、脆度始终高于对照组。贮藏0 d时，25CaE10处理组与对照组硬度存在显著差异（P＜0.05），在贮藏第1、3、5天时，相比于前一个采样时间点，自来水组的硬度下降率分别为2.05%、4.05%、15.11%，而25CaE10处理组为5.65%、0.93%、4.93%，说明CEW处理可以延缓绿豆芽的软化；贮藏5 d时，对照组绿豆芽的硬度与0 d相比显著降低（P＜0.05），为355.67 g，而25CaE10组的硬度为456.33 g，约为对照组的1.28 倍。脆度的变化趋势与硬度相似，随着贮藏时间的延长，脆度变化较为缓慢，处理组与对照组之间存在显著差异（P＜0.05）。在贮藏过程中，相比于前一个采样时间点，对照组的脆度下降率分别为5.44%、9.48%、5.42%，而25CaE10处理组分别为1.59%、6.20%、3.78%；贮藏5 d时，处理组脆度仍然可达529.67 g，约是对照组的1.21 倍。说明CEW处理一定程度上可以有效延缓绿豆芽硬度以及脆度的下降，保持质地和口感。

图4 CEW处理对绿豆芽贮藏过程中硬度（A）、脆度（B）的影响Fig.4 Effects of CEW treatment on hardness (A) and brittleness (B) of mung bean sprouts during storage

2.4 绿豆芽贮藏过程中微生物数量的变化

从图5可以看出，在低温贮藏过程中，对照组和25CaE10处理组绿豆芽的菌落总数均表现为逐渐增加的趋势，贮藏0 d即绿豆芽采收时，处理组的菌落总数显著低于对照组，贮藏过程中，25CaE10处理组的菌落总数始终低于对照组（P＜0.05）。同时，在贮藏期间，25CaE10处理组的菌落总数与对照组之间始终存在显著差异（P＜0.05），贮藏1、3、5 d 时，其菌落总数对数值较对照组分别降低约1.08、1.09、0.71（lg（CFU/g））。说明CEW处理可以有效减少菌落总数，抑制微生物生长，这也为延长绿豆芽货架期和提高豆芽品质提供了有力保障。

图5 CEW处理对绿豆芽贮藏过程中菌落总数的影响Fig.5 Effects of CEW treatment on total bacterial count in mung bean sprouts during storage

2.5 CEW处理对绿豆芽采后低温贮藏过程中褐变的影响

贮藏期间绿豆芽的外观以及褐变情况如图6所示。对照组绿豆芽在贮藏3 d时已有较为明显的失水皱缩和褐变现象，贮藏5 d时品质劣变现象加重，而25CaE10处理组状况良好。从图6B可以看出，在贮藏过程中，对照组和25CaE10处理组绿豆芽的褐变指数均表现为逐渐增加的变化趋势，25CaE10处理组的褐变指数始终显著低于对照组（P＜0.05），并且随着贮藏时间的延长，差异逐渐明显；贮藏3 d时，对照组绿豆芽的褐变指数明显增加，从贮藏1 d时的3.25增加到贮藏3 d时的4.90，而处理组的褐变指数增加缓慢，贮藏3 d时为3.14，相比对照组降低约35.9%；贮藏5 d时，处理组褐变指数为3.51，相比对照组降低了约33.9%。由此可见，CEW处理一定程度上可以抑制绿豆芽的褐变，延缓品质劣变。

图6 绿豆芽贮藏过程中外观（A）及褐变指数（B）的变化Fig.6 Changes in visual appearance (A) and browning index (B) of mung bean sprouts during storage

2.6 CEW处理对绿豆芽贮藏过程中总酚及褐变相关酶的抑制作用

如图7A所示，两组总酚含量均随着贮藏时间的延长略有增加，但25CaE10处理组的总酚含量始终显著低于对照组（P＜0.05），在贮藏3 d和5 d时，其总酚含量分别为0.864、1.026 mg/gmf，相较对照组分别降低约25.8%、19.8%。酚类物质作为酶促褐变的重要底物，其含量的降低有利于控制酶促褐变，进一步说明CEW处理可在一定程度上抑制绿豆芽褐变。

图7 CEW处理对绿豆芽贮藏过程中总酚含量（A）及PPO（B）、POD（C）、PAL（D）活力的影响Fig.7 Effects of CEW treatment on total phenol content (A) and PPO (B),POD (C) and PAL (D) activity of mung bean sprouts during storage

从图7B～D可以看出，在低温贮藏前期，对照组和25CaE10处理组绿豆芽的PPO、POD、PAL活力变化趋势一致，均表现为贮藏前期逐渐增加，贮藏第5天时开始下降，25CaE10处理组相关酶活力始终显著低于对照组（P＜0.05）。贮藏1 d，各组别PPO活力缓慢增加，到贮藏3 d时，对照组绿豆芽的PPO活力大幅度提高，从贮藏1 d的525 U/（gmf·min）增加到1 200 U/（gmf·min），增加了约1.29 倍，而25CaE10处理组的PPO活力相对较低，只有350 U/（gmf·min），相比对照组活力降低了约70.8%。绿豆芽POD活力同样在贮藏3 d快速增长，25CaE10处理组的POD活力仍低于对照组，其活力为965 U/（gmf·min），相比对照组的1 317.5 U/（gmf·min），降低了约26.8%。此外，在贮藏过程中，绿豆芽的PAL活力较高，在贮藏3 d时，对照组的PAL活力为138.45 U/（gmf·h），而25CaE10处理组的活力为122.55 U/（gmf·h），降低约11.5%。通过对绿豆芽的褐变指数以及褐变相关酶的测定发现，绿豆芽在贮藏3 d时出现明显的褐变现象，CEW处理能够很好地抑制褐变相关酶活力，延缓绿豆芽的褐变。

3 讨论

果蔬在贮藏过程中，伴随着水分散失、组织软化、酶促褐变以及氧化损伤等导致品质劣变的过程。绿豆芽含水量极高，水分是新鲜果蔬重要的组成部分，蒸腾作用是导致水分流失的重要原因[21]。钙和电解水分别处理均能引起果蔬质量损失率的降低，减少水分损失[22-23]，本研究结果发现，CEW处理可降低绿豆芽的质量损失率，同时核磁共振检测水分状态结果表明，CEW处理后水分状态略有改变，结合水含量增加，导致水分不易散失。此外，贮藏期间的成熟软化是一个复杂的过程，涉及到细胞壁降解、呼吸作用、能量代谢、微生物侵染、乙烯调控等[24]。其中，细胞壁主要物质果胶和纤维素的降解是软化的主要因素[25]，细胞壁降解酶在其中发挥了主要的作用。钙和电解水处理都能够降低多聚半乳糖醛酸酶等细胞壁相关酶活力，抑制细胞壁成分分解[10,26]，同时钙作为细胞壁的主要结构物质，还可与细胞壁中的果胶结合形成果胶酸钙，进一步维持细胞壁强度，保持硬度[27]。本研究结果发现，CEW能够抑制绿豆芽的硬度降低，同时保持一定的脆度，推测机理与抑制各种细胞壁降解酶活力相关。

绿豆芽极易发生酶促褐变，褐变不仅影响产品外观还会影响食用品质。酶促褐变发生的三大必要条件包括氧气、PPO以及酚类底物。正常细胞中PPO与酚类物质是分离的，因此不易发生褐变，而当细胞膜受损后，二者相互接触，PPO被激活，催化酚类物质氧化聚合从而引起褐变[31]。因此，褐变的发生与细胞膜的完整性、总酚含量、PPO、POD、PAL等酶活力、ROS代谢等密切相关[31-32]。本研究结果表明，CEW处理可降低绿豆芽在贮藏过程中的褐变指数和总酚含量，同时抑制PPO、POD、PAL活力，配合相对电导率、MDA含量和H2O2含量的下降，从而有效缓解褐变。此外，综合分析褐变相关数据发现绿豆芽的褐变主要发生在贮藏3 d时，在此阶段施加干预，可以很好地抑制褐变现象。综上所述，CaCl2电解水处理对绿豆芽的采后低温贮藏保鲜具有一定的积极意义。

4 结论

利用含25 mmol/L CaCl2的电解水浸泡、喷淋绿豆萌发得到豆芽后，能够减少贮藏过程中绿豆芽的水分散失，增加结合水含量，保持硬度和脆度，降低表面微生物数量，维持细胞膜的完整性，减少代谢物MDA以及H2O2的积累，同时还可显著抑制褐变现象，降低酶促褐变底物酚类物质的含量以及褐变相关酶PPO、POD、PAL活力，延缓了品质劣变，对绿豆芽起到一定的保鲜效果。