动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对克林霉素诱导的抗生素相关性腹泻的改善作用

马 岩，王中江，杨靖瑜，李 哲，彭 霞，单秀峰，李柏良,*，马微微*

（1.沈阳师范大学实验教学中心，辽宁 沈阳 110034；2.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150000；3.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150000）

抗生素作为一种有效的治疗策略被用于疾病治疗。然而，长期使用抗生素会增加临床并发症的风险。抗生素相关性腹泻（antibiotic-associated diarrhea，AAD）是抗生素治疗最常见的副作用，各种抗生素均可能引起AAD，尤其是头孢菌素、克林霉素和氨基青霉素类抗生素的AAD发生率较高[1]。约5%～30%的患者发生在抗生素治疗期间或之后[2]，其特征是肠道微生物群被破坏，肠道短链脂肪酸水平降低，肠道碳水化合物和结肠胆汁酸积累，水分吸收改变，最终导致腹泻。

肠道菌群在调节宿主健康方面发挥重要作用，其定植可能受年龄、饮食、抗生素使用等环境因素影响。肠道菌群失衡可能导致多种生理和病理变化，如肥胖、2型糖尿病、心血管疾病、炎症性肠病等疾病[3-4]。研究表明肠道菌群与AAD的发病密切相关，并可能对AAD的严重程度产生显著影响[5-6]。

益生菌可通过调节人体肠道菌群的组成和功能，从而有益于人体健康，许多临床试验表明益生菌可以缓解AAD[7]。科学家已对多种菌株进行研究，包括芽孢杆菌、双歧杆菌、梭状芽孢杆菌、乳杆菌属、乳球菌属、明串珠菌属和链球菌属[8]。既往研究发现，丁酸梭菌与婴儿双歧杆菌联用可使小鼠血清中白细胞介素10（interleukin 10，IL-10）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）和干扰素γ（interferon γ，IFN-γ）恢复到正常水平，缓解小鼠AAD[9]。一种由动物双歧杆菌乳亚种和嗜热链球菌组成的益生菌配方奶粉可以显著降低婴儿AAD的发生率[10]。动物双歧杆菌乳亚种BB-12可通过调节肠道菌群有效缓解AAD[11]。然而，目前相关研究多数为国外菌株，缺乏国内相关菌株的研究，因此有必要系统地开发自主知识产权菌株。

前期研究表明动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）XLTG11具有预防和治疗结肠炎的作用[12]，因此，本研究旨在探讨动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD的缓解作用及其潜在机制，通过测定体质量增加量、盲肠质量、粪便含水量和粪便稠度评价动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD的缓解作用，并通过研究细胞因子、肠道屏障和核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信号通路相关基因表达、肠道菌群组成及短链脂肪酸水平探索动物双歧杆菌乳亚种XLTG11缓解AAD的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SPF级雄性6 周龄C57BL/6N小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2016-0006。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）检测试剂盒泉州科诺迪生物科技有限公司；D-乳酸、IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒 南京建成生物有限公司；RNA提取试剂盒 天根生化科技（北京）有限公司；GoScript™ Reverse Transcription Mix试剂盒、GoTaq®qPCR Master Mix试剂盒、实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒普洛麦格（北京）生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

DHP-9272型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；LDZF-50KB-II立式蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；TGL-16G离心机 上海安亭科技仪器厂；超低温冰箱 青岛海尔集团；Model 680型酶标仪 美国Beckman公司；ABI7500荧光定量PCR仪 美国Applied Biosystems公司；HALO-F100粪便处理仪 杭州海露科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与饲养

将48 只6 周龄C57BL/6N雄鼠适应性饲养一周，饲养温度（22±2）℃、相对湿度（55±5）%，自由采食与饮水，12 h/12 h光暗循环。适应性饲养结束后，随机分为4 组：对照组、模型组、双歧杆菌低剂量组和高剂量组，每组12 只。整个实验阶段内各组小鼠正常饮食，对照组灌胃无菌磷酸盐缓冲液0.2 mL/d，模型组及双歧杆菌低、高剂量组灌胃250 mg/（kgmb·d）克林霉素，连续14 d，诱导建立AAD模型。灌胃14 d后，对照组和模型组灌胃无菌磷酸盐缓冲液0.2 mL/d，双歧杆菌低、高剂量灌胃菌株浓度分别为5×106、1×107CFU的动物双歧杆菌乳亚种XLTG11菌液0.2 mL，持续14 d[12-13]。

1.3.2 小鼠体质量增加量、盲肠质量、粪便含水量和粪便稠度的测定

实验第1天和第28天均称量小鼠体质量，计算体质量增加量。小鼠处死后，取盲肠，测定盲肠湿质量。腹泻症状采用粪便含水量和粪便稠度进行评价。收集小鼠粪便，新鲜粪便称质量后烘干，再称质量。按下式计算粪便含水量。

粪便稠度评分按文献[14]所述评分标准进行，具体见表1。

表1 粪便稠度评分Table 1 Scoring criteria for fecal consistency

1.3.3 结肠组织细胞因子检测

采用相应试剂盒，按照试剂盒说明书操作测定结肠组织TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10水平。

1.3.4 肠道通透性检测

采用ELISA试剂盒测定血清LPS和D-乳酸质量浓度。

1.3.5 荧光定量PCR检测肠道屏障和NF-kB信号通路相关基因表达水平

采用荧光定量PCR法检测肠道屏障（闭锁小带蛋白1（zonula occludens 1，ZO-1）、Occludin、Claudin-1和黏蛋白2（mucin 2，MUC2））和NF-kB信号通路（Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）、髓分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88））和NF-κB相关基因表达水平。取适量结肠组织样本，组织匀浆机匀浆，参照试剂盒说明书提取结肠组织内总RNA，采用反转录试剂盒合成cDNA，按照GoTaq®qPCR Master Mix试剂盒配制反应液，用PCR试剂盒进行扩增。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，循环40 次，测定目的基因和内参基因β-actinCt值，按照2－ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达水平。引物序列见表2。

表2 PCR引物序列Table 2 Primer sequences used for polymerase chain reaction (PCR)

1.3.6 小鼠肠道菌群的测定

实验结束后，无菌采取小鼠肛门内粪便0.1 g，梯度稀释后，选择合适的稀释度分别接种在双歧杆菌琼脂、乳酸杆菌选择性琼脂、伊红美蓝琼脂、叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂和胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂平板检测粪便中双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌数量[15]。

1.3.7 短链脂肪酸含量测定

准确称取（0.80±0.01）g粪便放入粪便样本盒中，用粪便处理仪处理，用蒸馏水配制10%（质量分数）悬浊液，取500 μL悬浊液（液体培养基样本直接吸取500 μL）于1.5 mL离心管中，并加入100 μL巴豆酸偏磷酸溶液，－30 ℃下冷冻24 h，解冻后4 ℃、8 000×g离心3 min去除蛋白质等杂质，取上清液，用0.22 μm水系滤膜过滤，待测。气相色谱检测条件参考Shi Jialu等[16]的方法。

1.4 数据处理与分析

实验结果采用平均值±标准差表示，采用SPSS 17.0软件进行Duncan’ test进行差异显著性分析。P＜0.05为差异显著，采用Graph Pad软件进行绘图分析。

2 结果与分析

2.1 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD模型小鼠生理表观变化的影响

如图1A所示，相比于对照组，模型组小鼠体质量增加量显著降低（P＜0.05），相比于模型组，低、高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11均可以显著提高体质量增加量（P＜0.05），且高剂量组与对照组无显著差异（P＞0.05）。如图1B所示，相比于对照组，模型组小鼠盲肠质量显著增加（P＜0.05），相比于模型组，高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以显著降低盲肠质量（P＜0.05），而低剂量组与模型组无显著差异（P＞0.05）。如图1C所示，相比于对照组，模型组小鼠粪便含水量显著增加（P＜0.05），相比于模型组，低、高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11均可以显著降低小鼠粪便含水量（P＜0.05），且高剂量组显著低于低剂量组（P＜0.05）。如图1D所示，相比于对照组，模型组小鼠粪便稠度评分显著增加（P＜0.05），相比于模型组，低、高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11均可以显著降低小鼠粪便稠度（P＜0.05）。以上结果表明动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以有效缓解AAD相关症状。

图1 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD模型小鼠生理表观指标的影响Fig.1 Effect of Bifidobacterium animalis subsp.lactis XLTG11 on physiological indexes of mice with antibiotic-associated diarrhea

2.2 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD模型小鼠结肠细胞因子质量浓度的影响

AAD伴随全身炎症的发生，细胞因子作为炎症发生的标志物，常用于评价AAD的程度。如图2A～C所示，与对照组相比，模型组小鼠结肠中促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）水平均显著升高（P＜0.05），表明克林霉素处理导致促炎因子分泌增加，促使炎症发生。高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以显著降低结肠中TNF-α、IL-1β和IL-6水平（P＜0.05），而低剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11仅可以显著降低结肠中IL-6水平（P＜0.05）。如图2D所示，模型组小鼠结肠中抗炎细胞因子（IL-10）水平显著低于对照组（P＜0.05），低、高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11均可以显著提高结肠中IL-10水平（P＜0.05），且高剂量组与对照组无显著差异（P＞0.05）。以上结果表明高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11具有良好的抗炎效果。

图2 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD模型小鼠结肠中细胞因子水平的影响Fig.2 Effect of Bifidobacterium animalis subsp.lactis XLTG11 on colonic cytokine contents in mice with antibiotic-associated diarrhea

2.3 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD模型小鼠肠道屏障通透性的影响

LPS和D-乳酸是在分子水平上检测肠屏障损伤的敏感指标。如图3所示，与对照组相比，模型组小鼠血清中LPS和D-乳酸水平均显著升高（P＜0.05），表明克林霉素处理可以导致肠道屏障通透性增加。低、高剂量的动物双歧杆菌乳亚种XLTG11均可以显著降低AAD模型小鼠血清中LPS和D-乳酸水平（P＜0.05），且高剂量组D-乳酸浓度显著差异低于低剂量组（P＜0.05）。以上结果表明高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11具有良好的降低肠道屏障通透性效果。

图3 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD模型小鼠血清中LPS（A）和D-乳酸（B）水平的影响Fig.3 Effect of Bifidobacterium animalis subsp.lactis XLTG11 on serum LPS (A) and D-lactic acid (B) levels in mice with antibioticassociated diarrhea

2.4 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD模型小鼠肠道屏障功能相关基因的影响

紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin和Claudin-1）和黏蛋白（MUC2）是重要的肠道屏障功能蛋白。如图4所示，相比于对照组，模型组小鼠结肠ZO-1、Occludin、Claudin-1和MUC2mRNA表达水平显著下调（P＜0.05），表明克林霉素处理造成肠道屏障功能受损。与模型组相比，低、高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11均可以显著上调Claudin-1、Occludin、ZO-1的mRNA表达水平（P＜0.05），高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以显著上调MUC2mRNA表达水平，而低剂量组MUC2mRNA表达水平与模型组无显著差异（P＞0.05）。以上结果表明，高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以有效缓解AAD模型小鼠肠道屏障功能蛋白的损伤。

图4 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD模型小鼠肠道屏障相关基因表达水平的影响Fig.4 Effect of Bifidobacterium animalis subsp.lactis XLTG11 on intestinal barrier related gene expression in colonic tissues of mice with antibiotic-associated diarrhea

2.5 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD模型小鼠肠道菌群的影响

肠道菌群对AAD发病具有重要影响。如图5A、B所示，与对照组相比，模型组小鼠肠道中双歧杆菌和乳杆菌数量均显著降低（P＜0.05），表明克林霉素处理降低了有益菌活菌数，而低、高剂量的动物双歧杆菌乳亚种XLTG11均可以显著增加双歧杆菌和乳杆菌的数量（P＜0.05），且高剂量组显著高于低剂量组（P＜0.05）。如图5C～E所示，与对照组相比，模型组小鼠肠道中肠杆菌、肠球菌和产气荚膜梭菌数量均显著增加（P＜0.05），与模型组相比，高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以显著降低肠杆菌、肠球菌和产气荚膜梭菌数量（P＜0.05），而低剂量组与模型组无显著差异（P＞0.05）。由此可知，高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以有效调节AAD模型小鼠的肠道菌群。

图5 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD模型小鼠肠道菌群的影响Fig.5 Effect of Bifidobacterium animalis subsp.lactis XLTG11 on the gut microbiota in mice with antibiotic-associated diarrhea

2.6 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD模型小鼠结肠内短链脂肪酸含量的影响

短链脂肪酸是肠道菌群的重要代谢产物，可以有效缓AAD，因此本研究进一步分析肠道中短链脂肪酸含量。如图6所示，与对照组相比，模型组小鼠粪便中乙酸、丙酸和丁酸含量均显著降低（P＜0.05），而低、高剂量的动物双歧杆菌乳亚种XLTG11均可以显著增加小鼠粪便中乙酸、丙酸和丁酸含量（P＜0.05），且高剂量组显著高于低剂量组（P＜0.05）。由此可知，动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以有效增加小鼠粪便中短链脂肪酸含量。

图6 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD模型小鼠粪便中短链脂肪酸含量的影响Fig.6 Effect of Bifdiobacterium animalis subsp.lactis XLTG11 on short chain fatty acid contents in the feces of mice with antibiotic-associated diarrhea

2.7 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD模型小鼠结肠NF-κB信号通路的影响

为研究NF-κB信号通路是否在动物双歧杆菌乳亚种XLTG11缓解AAD机制中发挥重要作用，对其相关基因的mRNA表达水平进行测定，结果如图7所示。与对照组相比，模型组中TLR4、MyD88和NF-κB基因表达水平显著上调（P＜0.05），低剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以显著下调TLR4和NF-κB表达水平（P＜0.05），高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11能够显著下调TLR4、MyD88和NF-κB的表达水平（P＜0.05），表明动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活进而发挥抗炎功能。后续将采用Westernblot技术进一步分析相关蛋白表达水平的差异。

图7 动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD模型小鼠结肠组织NF-κB信号通路相关基因表达水平的影响Fig.7 Effect of Bifidobacterium animalis subsp.Lactis XLTG11 on the mRNA expression levels of genes related to the NF-κB signaling pathway in mice with antibiotic-associated diarrhea

3 讨论

在临床治疗中，抗生素对治疗各种细菌感染具有良好的效果。然而，长期使用抗生素会增加患者临床并发症，例如AAD。AAD不仅会严重阻碍疾病的康复，而且还威胁着患者的生命安全[6]。越来越多的证据表明，益生菌具有预防和治疗AAD的前景[17]。前期研究表明动物双歧杆菌乳亚种XLTG11具有预防和治疗结肠炎的作用[12]，因此，本研究旨在探讨动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对AAD的改善作用及其潜在机制。

小鼠体质量增加量、盲肠质量、粪便含水量和粪便稠度是常用于评价腹泻程度的指标[18]。AAD伴随全身炎症的发生，促炎细胞因子分泌增加，而抗炎细胞因子水平降低[9]。TNF-α是一种关键的促炎因子，可与多种细胞因子协同作用，进一步诱导体内炎症介质的释放[19]。IL-6在肠上皮屏障中起重要作用，可通过激活Claudin-2基因调节肠上皮紧密连接[20]。过量的IL-1β促进了其他炎症因子的表达，增强了内皮细胞和上皮细胞的通透性，加重了肠黏膜的炎症[21]。IL-10是一种主要的抗炎细胞因子，在维持胃肠道稳态中起着至关重要的作用[22]。本研究发现克林霉素处理显著提高了小鼠结肠组织的TNF-α、IL-1β和IL-6水平，降低了IL-10水平，这与Hu Jinshaung等[23]研究结果一致，动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以降低小鼠结肠组织中促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平，提高抑炎细胞因子IL-10水平，这与Ling Zongxin等[9]研究结果较为一致。

肠道屏障功能在肠道炎症的发展中起着至关重要的作用[24]。紧密连接蛋白主要包括跨膜蛋白（Occludin和Claudins）和辅助蛋白（ZO-1和ZO-2），它们是肠黏膜屏障的主要成分，影响肠黏膜的通透性和完整性[25]。黏蛋白（包括MUC1和MUC2等）在肠道上皮细胞表面形成黏膜屏障，其异常表达导致屏障结构破坏，是肠道炎症的启动因子[26]。本研究发现高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以显著提高Claudin-1、Occludin、ZO-1和MUC2的mRNA表达水平，表明动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以通过提高肠道屏障功能进而可以改善AAD。这与长双歧杆菌CCM 7952可以上调小鼠肠道上皮中ZO-1和Occludin的表达，降低结肠通透性的结果[27]相似。

短链脂肪酸不仅可以提高肠道屏障作用，还作为重要的信号分子，具有调节NF-κB信号通路的功能[26,28]。本研究发现，高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以显著提高AAD小鼠粪便短链脂肪酸含量。TLR4介导的信号通路通过识别配体与其主要适应性分子MyD88结合，进而进行细胞内信号转导，激活NF-κB信号通路，破坏肠道免疫稳态，最终导致炎症发生[29-31]。TLR4是TLR家族中最早发现的跨膜受体，具有调节免疫反应和促炎作用[32]。MyD88是TLR4信号转导过程中的重要衔接蛋白，也是NF-κB信号通路的上游信号分子，可触发信号级联激活下游NF-κB[33]。结肠组织中NF-κB水平可以反映炎症的严重程度[34]。本研究发现，高剂量动物双歧杆菌乳亚种XLTG11可以显著下调TLR4、MyD88和NF-κB基因表达水平，这与Wang Nana等[12]关于动物双歧杆菌乳亚种XLTG11缓解溃疡性结肠炎的结果一致。

综上，动物双歧杆菌乳亚种XLTG11能够改善AAD模型小鼠腹泻相关的指标，调节细胞因子和肠道菌群组成，提高短链脂肪酸含量，提高肠道屏障相关基因的表达和抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活，进而有效缓解克林霉素诱导的AAD。