茶多酚对围产期奶牛乳腺炎的调节作用及机制

■孙奕烁 安彦昊 马学虎 窦文丽 宝 华 马燕芬，*

（1.宁夏大学农学院，宁夏回族自治区反刍动物分子细胞育种重点实验室，宁夏银川 750021；2.内蒙古自治区农牧业科学院，动物营养与饲料研究所，内蒙古呼和浩特 010031）

奶牛健康养殖与消费者餐桌上乳制品质量密切相关。因此，保证奶牛健康生长和泌乳是十分重要的。围产期（产犊前21 d 至产犊后21 d）作为奶牛泌乳周期中极为重要的一段时间，需要经历妊娠、分娩、泌乳、换料、环境变化等重要的生理和代谢变化过程，从而遭受一系列应激导致奶牛产生自由基和清除自由基的能力失衡，能量需求和耗氧量需求增大，活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成增多，降低了奶牛机体的抗氧化能力，引起机体脂质过氧化，导致奶牛就会处于氧化应激（oxidative stress, OS）状态[1]。持续的氧化应激不仅会损伤奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells, bMECs）的功能，还会影响奶牛的产奶量和乳制品的质量[2]，同时也是降低围产后期奶牛免疫功能、增加炎症反应的一个关键原因[3]。因此，降低和预防奶牛乳腺上皮细胞产生的氧化应激对促进奶牛健康泌乳具有重要意义。茶多酚可以通过抑制丙二醛（malondialdehyde, MDA）和ROS 的产生，提高血清中抗氧化酶活性，降低机体脂质过氧化水平，进而减缓奶牛乳腺上皮细胞产生的氧化损伤[4]，在环保无毒副作用、不产生耐药性的前提下，可应用于预防围产期奶牛乳腺炎的形成且在加快奶牛健康绿色养殖方面发展前景极为广阔。

1 围产期奶牛乳腺炎致病机制

1.1 氧化应激诱导的乳腺炎

围产期奶牛面临泌乳能量需求远大于干物质摄入量的问题，极易造成能量负平衡（negative energy balance, NEB），引起机体动员大量脂质代谢从而显著增加ROS和自由基的产量，产生的多余的ROS和自由基就会随血液循环进入乳腺并聚集在乳腺内，如果不能及时清除，极易使奶牛机体产生氧化应激导致全身机体免疫应答降低，进而引起机体免疫功能失衡，最终导致乳腺炎的发生[5]。研究发现，氧化应激诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性反应是由于氧化应激激活了如丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）、NF-κB（nuclear factor-kappaB, NF-κB）等多个信号通路[6]而导致的。在氧化应激状态下，由线粒体持续生成的ROS 能通过激活MAPK 信号通路下游的c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）、细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal regulated kinase 1/2, ERK1/2）和p38MAPK，从而诱发细胞炎性反应和凋亡[7]；其次，ROS还可以通过激活ERK、NF-κB、p38MAPK 信号通路，从而激活Nalp-3炎性复合体引起炎性反应[8-10]；此外，作为胞内模式识别受体的Nalp-3炎性复合物还能够加快白细胞介素-18（Interleukin-18, IL-18）与白细胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）成熟，从而引起炎性反应的发生[10]。NF-κB与MAPK信号通路还可以通过增强肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的表达，诱导细胞炎性反应和凋亡[11]，引起奶牛乳腺产生炎症，使奶牛免疫功能降低，导致奶牛乳腺炎的发生[12]。

1.2 高精料日粮诱发的乳腺炎

随着消费者生活水平提高和居民饮食结构改变，加大了对乳产品的需求。为了极大程度提高奶牛产奶量，通常会增加奶牛日粮中的精料比例。但长时间饲喂高精料日粮会出现奶牛瘤胃菌群紊乱等一系列问题，导致瘤胃释放大量的细菌内毒素脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）[13]，引发奶牛发生亚急性瘤胃酸中毒（subacute ruminal acidosis, SARA）[14]，显著降低瘤胃液pH，增加瘤胃肽聚糖片段—γ-D-谷氨酸-内消旋-二氨基庚二酸（γ-d-glutamyl-meso-diaminopimelic acid, iE-DAP）浓度并使其易位进入血液，通过触发奶牛乳腺中的核苷酸寡聚化结构域蛋白1（Nucleotide oligomerization domain protein 1, NOD1）/半胱天冬酶-8（Caspase-8）途径来诱导乳腺上皮细胞产生炎症和凋亡[15]。高精料日粮诱导的奶牛SARA会增加iE-DAP 浓度，iE-DAP 结合NOD1 后激活了奶牛乳腺中炎性转录因子NF-κB，引发乳腺促炎反应，显著上调促炎因子IL-1β、白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）和TNF-α的表达量[16]。此外，Toll 样受体4（Tolllike receptor 4, TLR4）/NF-κB信号通路在奶牛高精料日粮诱导的乳腺中也会被激活，TLR4被LPS激活后，紧接着会激活髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88）的依赖途径和下游信号分子，包括NF-κB、MAPK 和干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor 3, IRF3），促使乳腺分泌大量炎细胞因子，最终诱发乳腺炎[17]。这表明NOD1/NF-κB 和TLR4/NF-κB两种炎症信号通路协同触发了高精料日粮诱导的乳腺中的促炎反应，这种协同作用无疑加剧了SARA诱导的乳腺的损伤。另外，饲喂高精料日粮也会引起消化道衍生的LPS 和组胺激活奶牛乳腺中的炎症反应[17-18]，增加了瘤胃屏障、肠道屏障和血乳屏障的通透性[19]。由于奶牛产后大量泌乳，乳腺血流量增加，大量的LPS和组胺就会经血液循环聚集在乳腺组织中，从而导致奶牛乳腺发生炎性反应。因此，奶牛泌乳初期和高峰期饲喂高精料日粮导致的SARA可能与奶牛乳腺炎的发生密切相关。

1.3 病原微生物入侵引起的乳腺炎

病原微生物入侵也是引起奶牛乳腺炎的主要诱发因素之一，致病菌突破乳头管的屏障侵入乳腺组织后迅速定植并且产生大量内毒素和外毒素。乳头管因其结构与内衬的角质蛋白成为预防病原菌入侵的第一道物理性防御屏障，可以封闭管道，角质蛋白中的高浓度脂肪酸还能够精准杜绝病原菌与细菌的繁殖，乳头末端含有的括约肌也对病原菌入侵乳腺起到主要屏障作用，可以在乳汁与外界病原菌之间建立一道屏障，以防止细菌入侵；其次，乳汁中的杀菌成分和体细胞，尤其是中性粒细胞和巨噬细胞也有免疫防御作用。但是，如果挤奶后乳腺导管的括约肌开放、闭合不全或者乳头管的角蛋白塞部分丢失，那么就会损伤乳房的第一道物理性防御屏障，很容易导致病原菌突破乳头管的屏障侵入乳腺增加感染乳腺的几率[20]。奶牛乳腺炎根据流行病学分为环境性乳腺炎和传染性乳腺炎[21]。环境性病原微生物大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）主要通过乳头孔进入乳头管后，在乳池或乳腺中大量繁殖感染，导致乳汁异常，乳腺产生局部炎症甚至全身性临床症状[22]，其主要毒力因子LPS激活TLR4 后，激活MyD88 依赖途径，活化的MyD88可与IL-1 受体相关激酶（interleukon-1receptorassociatedkinase, IRAK）和转化生长因子β激活性激酶（TGFβ-activated kinase 1, TAK1）结合，最终激活NFκB，诱导乳腺产生促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和白细胞介素-12（Interleukin-12, IL-12）[23]，并刺激趋化因子（如IL-8 和RANTES）的表达来诱导乳腺产生强烈的炎性反应[24]。传染性病原微生物金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）入侵乳腺组织后主要定植于乳头管，随之大量释放毒性休克综合毒素1（toxic shock syndrome toxin 1, TSST-1）、表皮剥脱毒素（exfoliative toxins）、葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxins, SE）和溶血素（hemolysins）等毒力因子[25]，这些毒力因子分泌在乳腺上皮细胞的表面并大量表达，紧接着迅速与宿主细胞外基质成分黏附进而损害宿主细胞甚至破坏机体免疫系统[26]。病原微生物刺激奶牛乳腺组织后会产生不良影响甚至会造成不可逆的损伤，导致产奶量下降给乳制品行业带来巨大损失[27]。

2 茶多酚

茶多酚是一种健康安全的植物制剂，是茶叶中多酚化合物的总称[28]，主要来源于各种茶叶、茶片、茶碎末和茶树鲜叶等原料中[29]，市场纯度90%茶多酚参考价格为340元/kg[30]，主要富含黄烷酮类、花色素类、黄酮醇类、花白素类和酚酸及缩酚酸类等生物活性化合物[31]，其中最重要的是黄烷酮类中的儿茶素类化合物，占茶多酚总量的65%～80%，为活性多羟基结构[32]。茶多酚具有良好的抗氧化、抗炎、抗菌、防癌和调节脂质代谢的作用[33]。茶叶中丰富多样的维生素和矿质元素，有助于维持动物机体的正常生长代谢，提高机体的免疫能力及抗氧化能力。因茶多酚具有营养丰富、价格低廉等特点又富含天然活性物质可以作为一种绿色安全的饲料添加剂应用在反刍动物的饲料原料中，具有极大的潜在发展市场，在动物生产中越来越受到重视。

3 茶多酚对围产期奶牛乳腺炎的调节作用

3.1 茶多酚在反刍动物中的应用

茶叶是一种价格适中、来源广泛、富含多种活性功能的天然植物。茶提取物可以作为畜禽的饲料原料或添加剂，具有很大的潜在发展市场。目前茶提取物在反刍动物中的应用越来越多。在奶牛上的研究发现，在饲料中添加1%乌龙茶粉饲喂奶牛后，能提高奶牛产奶量10%以上，节约饲养成本，提高经济效益[34]。日粮中添加20 g/（头·d）绿茶提取物能够增加奶牛机体抗氧化能力和免疫力，降低乳中体细胞数，提高奶牛产奶量[35]；而在奶牛日粮中添加50 g/（头·d）纯度为23%的茶多酚除能够提高奶牛机体免疫能力和产奶量外，还能发挥抗菌作用[36]。本课题组的研究也发现，在奶牛围产期补充0.2 g/kg 茶多酚能够通过增加血浆中抗炎细胞因子浓度，降低促炎细胞因子浓度，缓解高酮血症奶牛的炎症反应，进一步改善哺乳早期高酮血症奶牛的产奶量和健康状况[37]。奶牛饲粮中适量添加茶及其副产品除了能够提高奶牛乳产量和乳品质还能改善奶牛肠道微生物的菌群数量。以上奶牛方面的研究提示茶多酚作为一种价格适中且具有多功能的活性物质，具有抗氧化作用和抗炎作用，可提升奶牛健康状况和生产性能。在羊上的研究发现，在日粮中添加80 mg/（只·d）茶多酚能够提高波尔山羊血清中的抗氧化能力，并且在开始饲喂后的30 d左右，其血清的抗氧化水平达到高峰[38]。在反刍动物上的研究说明茶多酚作为饲料添加剂在促进反刍动物健康和生产性能方面有很大作用。此外，在反刍动物饲粮中添加适量的茶多酚还能够抑制乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）的活性，缓解氧化应激对反刍动物的损害，提升反刍动物免疫力方面有很大作用[39]。

3.2 茶多酚的抗氧化作用及机制

反映机体总抗氧化能力（total antioxidant capacity, T-AOC）的生物标志物主要有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）、谷胱甘肽硫转移酶（glutathione S-transferase, GST）、过氧化氢酶（Catalase, CAT）、MDA和α-生育酚等[40]。提升围产期奶牛的T-AOC能够显著降低围产期奶牛由氧化应激引起的乳腺炎发病率[41]。在奶牛饲粮中添加茶多酚能够增强血清中抗氧化酶GSH-Px、SOD 和CAT 活性，降低血清中MDA含量，同时降低机体脂质过氧化水平[33，42-43]，抗氧化酶对自由基有高效清除作用，可以更好的清除自由基[44]。茶多酚里的酚羟基可结合氢离子生成酚氧自由基，灭活活性较强的自由基[45]。口服灌喂伤寒沙门氏菌感染的小鼠茶多酚，可以增强SOD 和CAT 活性，降低MDA 含量，表明茶多酚具有调节鼠伤寒沙门氏菌所致回肠损伤过程中氧化应激的能力[46]。在H2O2诱导的bMECS模型中，茶多酚可以通过下调MAPK通路中ERK1/2 和p38MAPK 的表达来促进核因子E2 相关 因 子2（nuclear factor erythroidderived 2-like 2,NFE2L2）介导的血红素氧合酶1（Heme oxygenase 1,HMOX-1）的表达，从而减缓bMECS受到氧化应激造成的损伤[47]。茶多酚中的多酚类化合物作为发挥抗氧化作用的主要因子可能是茶多酚能够显著提高机体抗氧化水平的关键作用机制，它能够激活NFE2L2/HMOX1 通路增加抗氧化酶活性，抑制与ROS 生成有关的酶进而清除ROS，使细胞产生的氧化损伤有所缓解[4]。以上结果提示，茶多酚可以显著增加机体抗氧化水平，对自由基有高效清除作用，在加强奶牛健康绿色养殖方面寓意深远。

3.3 茶多酚的抗炎作用及机制

围产期奶牛氧化应激与炎症关系密切[48]。氧化应激促发炎性反应的方式主要是通过激活促炎因子信号通路。如ROS 能够激活氧化还原敏感的转录因子NF-κB，引起一系列促炎因子和其他的脂质介质表达上调，造成乳腺组织炎性损伤，引起乳腺炎[22]。多酚类化合物具有抗炎作用，其抗炎机制主要是通过调控抑制多种炎症信号通路，抑制多种细胞因子和参与促炎相关的酶如环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）与诱导型一氧化氮合酶（induciblenitric oxide synthase, iNOS）来抑制巨噬细胞的吞噬速率继而下调促炎细胞因子的表达。如茶多酚中黄酮类化合物柚皮素和桑色素可通过调控低氧诱导因子-1（Hypoxia inducible factor-1, HIF-1）、NF-κB 和MAPK 信号通路，降低促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β的表达，减轻LPS 诱导的bMECS炎症[49-50]。此外，茶多酚中表儿茶素通过抑制bMECs 中IκB 激酶β（inhibitor kappa B kinaseβ,IKKβ, IKK-β）激酶活性，从而降低了NFκB通路的活性，进而下调炎性介导因子COX-2和iNOS的表达，降低前列腺素E2（prostaglandinE2, PGE2）和一氧化氮（nitric oxide, NO）的表达[51]，最终导致促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达量显著下调，从而发挥抗炎作用[52]。此外，茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechingallate, EGCG）能够通过上调几种不同的miRNA 从而影响基因调控和细胞增殖和凋亡等细胞功能[53]。EGCG通过促进人类软骨细胞中has-miR-140-3p 的表达来抑制IL-1β诱导的解聚素金属5 蛋白酶（depolymerizing metalloproteinase 5）的表达从而抑制炎性反应[54]。以上研究说明，茶多酚发挥抗炎作用的方式主要有：抑制炎性反应的多种信号传导途径，从而下调促进炎症级联发应的促炎细胞因子和炎症介导因子的表达；通过调控miRNA 进而调控基因表达和细胞功能。所以，利用茶多酚来抑制促炎细胞因子表达抑制炎症级联反应，可为我们预防围产期奶牛乳腺炎发病提供一种新思路。

3.4 茶多酚的抑菌作用及机制

E.coli和S.aureus是两种最为常见的突破乳头管屏障侵入围产期奶牛乳腺组织的外源致病菌，常会引起乳腺上皮细胞炎性反应，导致乳腺产生炎症[31]。茶多酚能够预防围产期奶牛乳腺炎是由于其能够抑制甚至杀死致病菌，其抑菌机制一是通过破坏细菌细胞膜的功能。细菌细胞膜是细菌内外环境之间的屏障，介导细菌与其直接环境的相互作用，因此对传染病的发病机制至关重要[55]，茶多酚能够破坏细菌细胞膜的磷脂双分子层结构，破坏细菌细胞膜，降低细菌和宿主细胞的结合能力[56]。二是抑制菌体蛋白质的合成与表达。茶多酚能够显著抑制大肠杆菌O157:H7 EDL933 生物膜的形成[57]，对E.coli的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）为40 μg/mL，说明茶多酚对E.coli有很强的抑菌效果，主要是通过作用于E.coli的细胞膜，改变其通透性而发挥抑菌作用[58]；茶多酚对S.aureus也有很强的抑菌效果，抑菌圈直径为（1.80±0.06）cm[59]，对S.aureus的最小抑菌浓度为8 mg/mL，当茶多酚浓度达到2 倍的最小抑菌浓度时，对S.aureus生物膜的产生具有显著的抑制作用[60]。上述研究表明，茶多酚抑制E.coli和S.aureus的作用机制是茶多酚能够作用于菌体细胞膜和DNA，改变细胞通透性、破坏菌体壁膜结构、抑制细菌生长、阻碍功能蛋白质与多糖的合成和表达，直接结合肽聚糖进而干扰其生物合成来抵抗致病菌，因此茶多酚在围产期奶牛乳腺炎疾病防治中应用前景广阔。

4 小结与展望

茶多酚因具有抗氧化作用、抗炎作用和抑菌作用，可用于防控围产期奶牛乳腺炎的发病，为生产中奶牛乳腺炎提出新的预防对策。但就目前来看，通过茶多酚来预防奶牛乳腺炎的作用机制研究还存在一定问题亟待解决，一是茶多酚对机体氧化应激导致炎症反应的作用靶点与作用机制需深度探索，二是要深入分析茶多酚在炎症反应信号转导途径调节方面的抗炎作用机制。目前，茶多酚依然是国内、外业界的研究热点，相信随着人们对茶多酚研究的进一步深入，茶多酚在奶牛健康绿色养殖的应用也将有更为广阔的前景。