Krt19在小鼠早期妊娠子宫的表达和调节

王 静,徐 鹏,王梦媛,孙 宇,孟令帅,李世杰,马兴红*

(1.东北农业大学 生命科学学院 黑龙江省动物细胞与遗传工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；2.哈尔滨医科大学 心肌缺血省部共建教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨150001)

早期妊娠的质量对妊娠晚期的事件和妊娠结局有重要影响。在小鼠早期妊娠中，最重要的事件包括胚胎着床和蜕膜化。胚胎着床是指具有着床能力的囊胚与处于接受态的子宫建立紧密联系的过程[1]。在小鼠中，根据早期妊娠子宫对胚胎着床敏感性和类固醇激素需求的不同，可以将子宫的状态分为3个主要时期：接受前期(妊娠1～3 d)、接受期(妊娠4 d)和非接受期(妊娠5 d以后)[2]。在小鼠中，卵巢分泌的甾类激素孕酮(P4)和雌激素(E2)通过结合各自的受体(P4受体：PR-A与PR-B；E2受体：ERα与ERβ)，调节子宫内膜细胞的增殖和分化[3]。其中，ERα、PR-A是参与调节小鼠子宫接受态和着床的主要受体[4-5]。小鼠胚胎着床发生在妊娠第4天晚上22:00点左右。着床的胚胎进一步刺激围绕其周围的基质细胞分化为不同形态和功能的蜕膜细胞，此过程称为蜕膜化。蜕膜提供给妊娠早期胚胎营养，限制胚胎过度侵入子宫，保护胚胎免于母体免疫攻击[6]。

胚胎着床前后，子宫上皮细胞经历细胞骨架重塑的过程，而维持上皮细胞结构完整性和免受外部压力的蛋白可能参与妊娠过程。哺乳动物胞质内细胞骨架由微丝、微管和中间丝构成，每一种成分都具有独特的结构和功能[7-8]。角蛋白是一种主要表达于上皮细胞的中间丝，作为细胞骨架结构中的一员，参与细胞的分裂、迁移以及分化、凋亡等过程[9]，对维持细胞结构的完整性和稳定性具有重要作用[10]。人类功能性角蛋白有54种，即28种Ⅰ型和26种Ⅱ型角蛋白。角蛋白19(Keratin19，Krt19)，相对分子质量为40 kDa，属于Ⅰ型角蛋白，其是肠、肾集合管、胆囊、间皮和分泌腺等上皮细胞中最具代表性的蛋白质之一[11-12]，还作为多种癌症的预后标志物[13-14]。鉴于Krt19在正常和癌变的上皮细胞中均表达，参与细胞骨架的形成，而胚胎着床前后涉及子宫上皮细胞骨架的重塑，推测Krt19可能参与该过程的调节。

为了探索在小鼠早期妊娠子宫中Krt19的表达与调节，本研究利用原位杂交、免疫组织化学、Western blot、real-time PCR等技术，结合小鼠早期妊娠模型、激素处理模型、延迟着床与激活模型和人工诱导蜕膜化模型，研究了Krt19 mRNA以及蛋白在小鼠子宫中的表达情况。研究结果可为深入了解Krt19在胚胎着床及蜕膜化过程中的作用及调节机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物实验室所用的ICR品系小鼠(6～8周龄)购自辽宁长生生物技术股份有限公司。控制其饲养环境，室温22℃，交替光照环境(12 h光照，12 h黑暗)，自由摄食及饮水。

1.2 主要试剂Krt19抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG购自Abclonal公司；GAPDH抗体购自Proteintech公司。

1.3 早期妊娠将健康性成熟的雄鼠与雌鼠按1∶2合笼，次日见栓并且阴道涂片发现精子的雌鼠记为妊娠第1天，分别在每日8:30完成妊娠1～8 d的小鼠子宫组织的收集。

1.4 类固醇激素处理切除健康性成熟雌鼠的双侧卵巢，恢复2周后皮下注射。对照组(Oil，Sigma)：芝麻油，0.1 mL/只；E2处理组(E2，Sigma)：100 ng E2，0.1 mL/只；P4处理组(P4，Sigma)：1 mg P4，0.1 mL/只；E2与P4共处理组(E2+P4)：(100 ng E2+1 mg P4)，0.1 mL/只。以上试剂均以芝麻油为溶剂进行配制，24 h后取材。

1.5 延迟着床与激活妊娠4 d的雌鼠切除双侧卵巢，分别做以下处理。延迟着床：妊娠5～7 d注射1 mg P4，0.1 mL/只，8 d取材。激活：7 d，皮下注射(25 ng E2+1 mg P4)，0.1 mL/只，终止延迟着床。8 d，通过尾静脉注射1%芝加哥蓝以确定激活成功。

1.6 人工诱导蜕膜化结扎性成熟雄鼠恢复后，与雌鼠1∶2合笼，见栓当天的雌鼠记为假孕第1天(PD1)。给PD4雌鼠的一侧子宫角注射25 μL芝麻油，另一侧不做任何处理作为对照，PD8完成取材。

1.7 原位杂交从NCBI数据库中获取小鼠Krt19基因的mRNA序列设计引物。Krt19引物为F：5′-GGTCAGTGTGGAGGTGGATTC-3′；R：5′-GGTGGGCAGATTGTTGTAGTG-3′,以cDNA为模板进行PCR扩增并纯化产物，连接T载体，探针利用地高辛标记试剂盒(Roche公司)进行标记。

1.8 免疫组织化学石蜡切片于60℃烘片30 min。脱蜡，酒精梯度入水，抗原修复并冷却至室温，3%双氧水处理10 min，马血清室温避光封闭1 h。4℃过夜避光孵育兔源Krt19多克隆抗体(1∶100)。HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶200)室温避光孵育1 h。水洗，DAB显色(中山金桥)，水洗，苏木精对染1 min。氨水返蓝、酒精梯度脱水和透明后封片。

1.9 Western blot检测根据蛋白浓度，按照所需蛋白量进行点样，电泳，转膜，37℃摇床振荡封闭1 h;使用Krt19多克隆抗体(1∶1 000)，4℃过夜避光孵育。配制PBST用于洗膜，山羊抗兔IgG(1∶1 000)37℃振荡孵育1 h;PBST洗膜，使用增强型ECL发光液曝光拍摄，Image J软件扫描条带，计算灰度值。

1.10 real-time PCR检测使用Primer 5.0设计引物，引物序列见表1。以小鼠子宫组织的cDNA为模板，使用TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(TaKaRa)进行反转录。采用Amplied Biosystems®7500 real-time PCR System(Amplied Biosystems)仪器收集荧光信号，并利用2-ΔΔCt法分析结果。

表1 引物信息

2 结果

2.1 小鼠早期妊娠子宫中Krt19 mRNA和蛋白的表达原位杂交结果显示，妊娠1～3 d，Krt19 mRNA在子宫上皮中表达比较强烈，且1 d信号最强,妊娠4 d的表达有所降低。与着床前相比，妊娠5～8 d的Krt19表达显著降低。妊娠5 d，其在上皮中也有表达，但是比前4 d信号弱，并且微弱表达于胚胎周围的子宫基质细胞中。妊娠6～8 d，Krt19 mRNA在胚胎周围的初级蜕膜区以及次级蜕膜区也有表达。此外，在6～8 d的胚胎中也有表达(图1A)。免疫组织化学结果与原位杂交结果基本一致，Krt19蛋白在小鼠早期妊娠1～4 d子宫腔上皮和腺上皮中的表达比较强烈，并且1 d表达最强。在5 d的子宫腔上皮和腺上皮以及在胚胎周围的基质细胞中也检测到微弱的表达。妊娠6～8 d，在残余的腔上皮中仍然检测到了其表达，在胚胎周围形成的初级蜕膜区以及次级蜕膜区也有表达，但是相比于1～4 d，着床后其表达较弱(图1B)。real-time PCR结果与原位杂交结果一致(图1C)。Western blot结果显示，Krt19蛋白在小鼠早期妊娠1～8 d子宫中的表达呈现逐渐下降的趋势，其中1 d表达最高。胚胎着床后，Krt19蛋白表达相对于着床前较低，结果与免疫组织化学结果基本一致(图1D，E)。

A.原位杂交结果；B.免疫组织化学结果；C.real-time PCR结果；D.Western blot结果(1～8.早期妊娠1～8 d);E.(D)中的灰度扫描结果。比例尺.100 μm；*** P<0.001

2.2 类固醇激素处理小鼠子宫中Krt19 mRNA和蛋白的表达原位杂交结果显示，在4组模型中，Krt19 mRNA在子宫腔上皮和腺上皮中均有表达。但是，与对照组相比，Krt19 mRNA在E2处理子宫的腔上皮与腺上皮中的表达比较强烈(图2A)。免疫组织化学结果与原位杂交结果相似(图2B)。real-time PCR结果与原位杂交结果相符，Krt19 mRNA在E2处理组中表达显著上调，差异极显著(P<0.001)，在其他组无明显变化(图2C)。Western blot结果显示，Krt19蛋白的表达情况与免疫组织化学结果基本一致(图2D，E)。

A.原位杂交结果；B.免疫组织化学结果；C.real-time PCR结果；D.Western blot结果；E.(D)中的灰度扫描结果。比例尺.100 μm；** P<0.01；*** P<0.001

2.3 延迟着床与激活子宫中Krt19蛋白的表达为了进一步检测Krt19的表达是否受着床胚胎活性状态的影响，因此，建立了延迟着床与激活模型。延迟着床状态子宫中的胚胎处于休眠状态，被E2重新激活进而着床。利用免疫组织化学和Western blot技术对其进行检测。免疫组织化学结果显示，在延迟着床模型的子宫中，Krt19蛋白高表达于腔上皮与腺上皮中。当胚胎被E2激活发生着床后，在着床位点处腔上皮、腺上皮中表达相对较弱，并且着床位点周围的基质细胞中也出现微弱表达。在非着床位点的上皮中，Krt19蛋白表达较强(图3A)。Western blot结果与免疫组织化学的结果相一致，Krt19蛋白在延迟着床模型中的表达显著高于激活模型中着床位点处(P<0.000 1)，同时，非着床位点的表达也显著高于着床位点处(P<0.001；图3B，C)。

A.免疫组织化学结果；B.Western blot结果；C.(B)中的灰度扫描结果。Activated-NI.激活模型的非着床位点；Activated-IS.激活模型的着床位点；Delayed.延迟模型子宫；比例尺.100 μm；*** P<0.001；**** P<0.000 1

2.4 人工诱导蜕膜化子宫中Krt19蛋白的表达为了进一步检测Krt19在小鼠子宫中的表达是否受蜕膜化的调节，使用芝麻油诱导蜕膜化来制备人工诱导蜕膜化模型。为了对其进行定位和相对定量检测，利用免疫组织化学和Western blot技术进行检测。免疫组织化学结果显示，在对照组中，Krt19蛋白强表达于腔上皮和腺上皮细胞中，基质细胞中未见表达。而在人工诱导蜕膜化小鼠子宫中，Krt19蛋白在蜕膜区表达(图4A)。Western blot结果与免疫组织化学结果一致，蜕膜子宫中的Krt19蛋白表达明显低于对照子宫中，差异极显著(P<0.000 1；图4B，C)。

A.免疫组织化学结果；B.Western blot结果；C.(B)中的灰度扫描结果。Decidualized.蜕膜子宫；Control.对照子宫；比例尺.100 μm；**** P<0.000 1

3 讨论

本研究运用原位杂交、real-time PCR、免疫组织化学、Western blot技术检测几种小鼠模型中Krt19的表达模式，进而判断其在小鼠妊娠过程中是否参与了胚胎着床过程以及是否受卵巢类固醇激素的调控。

子宫腔上皮细胞在正确的时间里进行增殖、分化和凋亡，才有利于滋养层细胞与母体子宫相互接触，并发生着床[15]。随着胚胎在子宫内的迁移和侵袭，这些机械应力会导致子宫上皮细胞骨架结构发生变化。角蛋白是细胞骨架结构的主要成员之一，可维持细胞结构的完整和稳定[16]。本试验首先检测了Krt19在早期妊娠子宫中的表达模式，发现其表达模式与上皮细胞的状态有关。妊娠1～2 d的小鼠子宫上皮细胞在排卵前卵巢分泌的E2的作用下进行增殖。结果表明，Krt19在妊娠1～2 d子宫的腺上皮与腔上皮中高表达，妊娠第1天表达量最高。妊娠第3天，新形成的黄体分泌的P4会刺激基质细胞进行增殖，同时也会拮抗上皮细胞的增殖作用。妊娠第4天，着床前的E2会出现一个小峰值，而在该E2峰与P4共同的作用下，基质细胞的增殖作用更加明显。同时，上皮细胞也是在这二者的作用下停止增殖进入分化状态。而Krt19在接受期(第4天)的子宫中的表达有所下降。我们发现，上皮细胞停止增殖开始分化的同时，Krt19表达下降了。相关研究已表明，Krt19可以作为多种细胞的分化标志物[17-19]，与本试验结果相符，提示Krt19可以作为子宫腔上皮分化的标志物。

胚胎着床过程中，E2和P4起着非常重要的作用。在妊娠过程中，很多基因的表达都受E2的上调，而E2是通过结合ER受体来发挥相应的作用。本研究结果显示，Krt19在E2处理子宫中高表达。已有研究表明，在乳腺癌上皮细胞以及子宫内膜癌细胞中[20-23]，E2结合ER可以促进Krt19的表达。因此，推测Krt19在接受前期上皮中强烈的表达，可能是E2通过结合ER进行调节的。

随着胚胎在子宫中继续侵入，胚胎周围的子宫内膜基质细胞分化为更大的圆形蜕膜细胞，此过程叫做蜕膜化[24-25]。蜕膜细胞也经历广泛的重塑以控制胚胎侵袭并适应不断生长的胚胎[26]。6～8 d，随着蜕膜化的进行，胚胎着床处的腔上皮逐渐凋亡，Krt19在子宫腔上皮仍然有表达，相比妊娠1～4 d较弱。并且在初级蜕膜区开始表达，继而扩展到次级蜕膜区。人工诱导蜕膜化模型进一步验证Krt19的表达是否受蜕膜化的影响。尽管Western blot结果表明，整个子宫组织Krt19蛋白在对照中的表达明显强于蜕膜子宫。但免疫组织化学结果显示，在蜕膜化的基质细胞中Krt19的表达比未发生蜕膜化的对照基质细胞的表达增强。以上说明，Krt19在小鼠子宫蜕膜化过程中可能起一定的作用。

此外，我们还发现，在6～8 d胚胎也检测到了Krt19的表达。此前也有研究表明，在小鼠胚胎中，Krt19可能在交配后9.5 d之前就能检测到[27]，而本试验在更早的时间(6～8 d)就检测到了Krt19的表达。TAMAI等[27]建立了Krt19基因敲除鼠，结果发现此鼠可育，并且胚胎发育与子代数目均正常，其又构建了Krt19和Krt8基因双敲除小鼠，结果发现(Krt19-/-，Krt8-/-)其胚胎在E9.5～E10.5致死在子宫中。HESSE等[28]建立了Krt19和Krt18基因双敲除鼠，同样发现(Krt19-/-，Krt18-/-)其胚胎在E9.5左右死在子宫中，致死率高达100%。这2种基因敲除鼠胚胎致死的原因可能是由于小鼠胚胎发生过程中角蛋白细胞骨架缺乏，使滋养层细胞变得脆弱。由此我们发现，Krt19敲除鼠没有出现任何明显的表型，可能是Krt18补偿的原因。而Krt19和Krt8或者Krt19和Krt18同时敲除，胚胎则会致死。这可能又提供了早期流产可能性的线索，即角蛋白表达异常，细胞骨架可能无法形成，导致滋养层缺陷以及母体和胚胎组织之间失去联系，从而导致流产。

妊娠成功需要处于接受态的子宫和活性状态的胚胎，才可以打开子宫的着床窗口，使得胚胎着床[29-30]。在延迟着床子宫中，Krt19蛋白仅高表达于腔上皮与腺上皮中，当胚胎被E2激活发生着床后，除在腔上皮、腺上皮中表达外，着床位点周围的基质细胞中也出现微弱表达。Western blot定量检测表明，Krt19蛋白在延迟着床中的表达显著高于激活模型中着床位点，同时，非着床位点处的表达也显著高于着床位点。以上结果提示，着床胚胎的活性状态可能会影响Krt19在子宫中的分布。

综上，本研究结果表明，Krt19在小鼠早期妊娠过程中可能参与胚胎着床与蜕膜化过程，并且受E2以及子宫内着床胚胎的活性状态的调节，本研究为胚胎着床分子机理的研究提供了新的视角，也为临床IVF胚胎着床失败的原因提供了一定的线索。