MicroRNA-15b与糖尿病视网膜病变患者外周血VEGF及相关炎症因子的关系△

马慧蕾 赵珺彦

糖尿病视网膜病变(DR)为糖尿病微血管并发症，早期无自觉症状，随着病情不断加重可伴有视力降低、复视、阅读困难等症状，若未及时治疗，可进展至增殖型糖尿病视网膜病变(PDR)，导致不可逆的视力丧失[1-2]。视网膜血管是糖尿病患者早期病理损伤的靶器官，高血糖可改变视网膜局部血管血流动力学，导致视网膜缺氧缺血，释放诸多促血管内皮生长因子及炎症细胞因子，进而诱导视网膜新生血管及纤维增生膜形成[3-4]。血管内皮生长因子(VEGF)是一种内皮细胞有丝分裂原，具有抑制内皮细胞凋亡及促进新生血管形成的作用，可增加视网膜毛细血管通透性，损伤血-视网膜屏障[5]。近年来，诸多研究证实，microRNA与血管病变密切相关，参与细胞增殖、凋亡、分化等生物学行为，并影响VEGF信号通路转导过程[6]。已有研究发现，miR-15b异常表达是糖尿病进展的危险因素之一，但关于miR-15b表达与DR是否相关的报道较少[7]。鉴于此，本研究就miR-15b与DR患者外周血VEGF及相关炎症因子的关系进行分析，旨在为DR患者的早期诊断寻求新的方向。

1 资料与方法

1.1 一般资料前瞻性研究。选取2019年6月至2021年3月就诊于本院的140例糖尿病患者，其中男56例，女84例；年龄34～71(54.56±5.11)岁。纳入标准：符合2017年版《中国2型糖尿病防治指南》[8]中2型糖尿病诊断标准；年龄≥18岁；自愿签署知情同意书。排除标准：入组前1个月接受降脂类、降压类、抗感染类药物治疗；非糖尿病引起的眼部疾病；伴有风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、甲状腺功能障碍等全身性疾病；合并视网膜静脉阻塞、葡萄膜炎、白内障、青光眼等其他眼部疾病；伴有糖尿病急性并发症、脑血管疾病、感染性疾病及其他内分泌代谢性疾病；急慢性感染、恶性肿瘤；长期接受新生血管药物或精神类药物治疗；凝血功能障碍；妊娠期或哺乳期。另选30名同期本院健康体检者作为健康对照(NC)组，无眼部疾病及糖尿病家族史。本研究经我院医学伦理委员会审批，遵循《赫尔辛基宣言》原则，患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 分组方法参考《我国糖尿病视网膜病变临床诊疗指南》[9]中视网膜病变程度分类标准，并结合荧光素眼底血管造影及裂隙灯显微镜眼底检查结果，将140例糖尿病患者分成3组。无DR(NDR)组：眼底无异常；单纯型DR(SDR)组：眼底无增殖性表现，仅见动脉瘤、静脉串珠样改变或视网膜出血；PDR组：存在玻璃体积血、新生血管生成或视网膜前出血中的一种或多种改变。

1.2.2 样本采集采集所有受检者5 mL空腹外周血(NC组于体检当日采集，糖尿病患者于治疗前采集)，注意避免乳糜血及溶血，于室温下静置35 min，在离心机上离心10 min，离心半径为6 cm，转速为3500 r·min-1，分离血清，并将其置于-80 ℃超低温冰箱中冷冻待测。

1.2.3 血清miR-15b表达将冷冻血清样本置于无菌环境下冰上解冻，加适量Trizol裂解液[爱必信(上海)生物科技有限公司]，参考Trizol试剂盒、总RNA提取试剂盒说明书提取血清总RNA，通过紫外分光光度计(美国NanoDrop公司)对RNA质量及浓度进行测定，通过逆转录试剂盒(上海研卉生物科技有限公司)将血清总RNA逆转录合成cDNA。采用全自动RT-PCR仪(美国ABI公司)对内参U6及miR-15b进行扩增反应。反应体系总体积为20 μL，反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，依次重复40个循环，基于全自动RT-PCR仪采集PCR扩增后的荧光信号，用2-ΔΔCt法计算miR-15b相对表达量。U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；miR-15b上游引物序列：5’-ATCCAGTGCCTGTCGTG- 3’，下游引物序列：5’-TGCTTAAGTGCTTCCAT- 3’。

1.2.4 血清VEGF及炎症因子ELISA检测试剂盒(购自武汉普锐泰生物科技有限公司)测定DR患者血清VEGF、ICAM-1、IL-1β、IL-8、hs-CRP、TNF-α水平。

1.2.5 微血管内皮功能指标通过NovoCyte流式细胞仪(上海然哲仪器设备有限公司)测定外周血内皮祖细胞(EPC)、循环祖细胞(CPC)、内皮细胞(CEC)比例。

2 结果

2.1 各组资料对比4组受检者性别、年龄、体重指数、收缩压、舒张压相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)；NDR组、SDR组、PDR组患者病程相比，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 各组受检者一般资料对比

2.2 血清miR-15b、VEGF、炎症因子水平4组受检者miR-15b、VEGF、炎症因子水平相比，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，其中血清miR-15b表达由低至高分别为PDR组、SDR组、NDR组、NC组，血清VEGF、ICAM-1、IL-1β、IL-8、hs-CRP、TNF-α水平由高至低分别为PDR组、SDR组、NDR组、NC组(表2)。

表2 各组血清miR-15b、VEGF、炎症因子水平对比

2.3 微血管内皮功能指标4组受检者微血管内皮功能指标水平相比，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，其中EPC、CPC水平由低至高分别为PDR组、SDR组、NDR组、NC组，CEC水平由高至低分别为PDR组、SDR组、NDR组、NC组(表3)。

表3 各组微血管内皮功能指标比较

2.4 相关性分析Pearson相关分析结果显示，DR患者血清miR-15b表达与VEGF、ICAM-1、IL-1β、IL-8、hs-CRP、TNF-α、CEC均呈负相关(均为P<0.05)，与EPC、CPC均呈正相关(均为P<0.05)(表4)。

表4 DR患者血清miR-15b表达与外周血VEGF、炎症因子、微血管内皮功能指标水平相关性

2.5 血清miR-15b表达对DR的诊断价值将miR-15b作为检验变量，将DR是否发生作为状态变量(0=无，1=有)，绘制ROC曲线，结果显示，miR-15b预测DR发生的AUC为0.869(95%CI为0.796～0.924)，诊断临界值为0.68，灵敏度、特异度分别为82.15%、79.50%，约登指数为0.617(图1)。

图1 血清miR-15b表达对DR的诊断ROC曲线图

3 讨论

DR发病机制复杂，多与炎症浸润、血糖代谢紊乱、氧化应激、视网膜血流动力学改变等因素相关[10]。视网膜毛细血管基膜增厚、视网膜屏障破坏、视网膜缺血缺氧所致新生血管生成是DR的主要病理改变，已证实miR-200b、miR-29c、miR-126等多种miRNA在DR新生血管生成中发挥促进或抑制作用，在防治DR中具有重要意义[11-12]。

miR-15b是miR-15/16家族成员之一，位于染色体3q25.33，广泛表达于机体各组织中，主要影响细胞的侵袭、凋亡、增殖等多种病理生理过程中。Li等[13]研究报道，miR-15b通过靶向大型肿瘤抑制激酶1(LATS1)抑制Hippo通路激活，参与肝细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭。Kim等[14]研究证实，miR-15b水平降低可通过介导血小板衍生生长因子(PDGF)信号通路表达而促进血管平滑肌细胞增生。刘有娅等[15]等研究发现，PDR患者的玻璃体内及视网膜增生膜组织中miR-15b水平较低，且其与成纤维细胞生长因子2(FGF2)表达呈负相关，二者共同作用可能通过激活各种通路而促进新生血管形成。毛莉等[17]研究发现，miR-15b通过对靶基因LPAR3在PI3K/AKT信号通路中的负向调控，激活VEGF信号通路，诱导新生血管形成。由此可以推测，miR-15b与新生血管形成指标有关。但目前临床关于miR-15b与DR新生血管生成的关系尚未完全阐明。

有研究发现，DR患者糖代谢受阻可造成血脂水平升高，而高脂可影响血流速度与血液黏度，加重视网膜缺血缺氧程度，同时调控血管细胞黏附分子-1表达，从而诱发内皮炎症反应与血管病变，进一步加重DR患者病变程度[16]。VEGF是诱发DR血管病变最强的促血管生长因子，可通过调控低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP-6)及血脂代谢过程、降低血管内皮细胞间紧密连接蛋白表达而参与疾病发展过程中。本研究结果发现，患者血清miR-15b表达：PDR组

慢性炎症反应在DR发生、发展中尤为关键，白细胞与视网膜毛细血管黏附及促炎性细胞因子释放均是DR发展中的初始事件。ICAM-1可介导炎症因子分泌，促使白细胞黏附于毛细血管内皮上，从而加重血管内皮受损程度；此外，ICAM-1可激活粒细胞跨内皮迁移，急剧释放大量炎症细胞因子及细胞毒性物质，进一步加重内皮炎症反应[19-20]。TNF-α通过破坏视网膜色素上皮细胞、视网膜内皮细胞之间的紧密连接，造成血-视网膜屏障受损，诱发其他细胞因子释放，进而调节血管舒缩反应及新生血管形成。在TNF-α刺激下，中性粒细胞、单核/巨噬细胞等诸多炎性细胞可分泌IL-8，加剧炎症反应[21-22]。本研究在对多组受检者间血清ICAM-1、IL-1β、IL-8、hs-CRP、TNF-α水平的比较中发现：PDR组>SDR组>NDR组>NC组，表明炎症因子与DR发生相关，且炎症反应程度与病情有关。本研究进一步分析miR-15b与炎症因子的相关性，结果发现，血清miR-15b表达与ICAM-1、IL-1β、IL-8、hs-CRP、TNF-α水平均呈负相关，由此可以推测，血清miR-15b可通过负反馈调节炎症反应而参与DR发生。绘制ROC曲线，miR-15b预测DR发生的AUC为0.869，诊断临界值为0.68，灵敏度、特异度分别为 82.15%、79.50%，约登指数为 0.617，提示血清miR-15b水平有效预测DR的发生。

综上所述，DR患者血清miR-15b的表达降低，与外周血VEGF及炎症因子水平密切相关，且在微血管损伤及炎症反应中均有重要参与作用，故临床应密切监测DR患者血清miR-15b的表达变化，应警惕血清miR-15b表达下调的患者，以预防DR的发生。然而本研究仍存在样本量少、样本范围单一等不足，针对miR-15b参与DR发病的确切机制及信号途径尚未完全阐明，故后期需展开进一步的体内、体外研究或动物实验，从基因、蛋白等不同的水平进行观察，探索miR-15b调控外周血VEGF及其他炎症因子的通路及可能机制，从而进一步探索miR-15b与DR的相关性。