丹酚酸A对小鼠心脏骤停复苏后心功能的保护作用

曹维锷 樊子旭 郑宏超 李艳杰 吉庆起

心脏骤停（CA）指突发心脏活动中止和体循环丧失，近年来心肺复苏（CPR）技术有了较大改进，但CA 仍是全世界成人死亡的主要原因之一。自主循环恢复（ROSC）后可出现心脏损伤、脑损伤以及全身其他脏器损伤，这与全身缺血再灌注后的瀑布式级联损伤效应有关,称为心脏骤停后综合征（PCAS）[1]。积极保护CPR 后心功能对改善复苏结果及预后至关重要。

丹酚酸A（Sal A）是从丹参中提取出的水溶性成分，具有抗炎、清除自由基以及调控能量代谢等功能[2]。研究发现，Sal A 通过降低线粒体膜电位、调节钙超载、增加心肌三磷酸腺苷（ATP）及抑制心肌凋亡，发挥抗心肌缺血再灌注性心律失常和损伤的作用[3]。Sal A 还可通过抑制心肌梗死后炎性细胞浸润和转化生长因子-β1（TGF-β1）/Smad2信号通路，减少心肌梗死面积，抑制心肌纤维化，进而减少急性冠脉综合征的发生[4-6]。本研究旨在探讨Sal A 在小鼠CPR 中的作用及潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

24 只雌性C57/BL6 小鼠（8～10 周龄，体质量20～25 g）购自上海杰思捷动物公司。Sal A 购自美国MedChemExpress 公司，氯化钾购自美国Sigma 公司，抗白细胞介素（IL）-10 抗体、抗肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抗体购自英国Abcam 公司。

1.2 心肺复苏模型构建及分组

雌性小鼠随机分成3 组：对照组、Vehicle 组和Sal A 组。小鼠饲养于SPF 级环境中，12 h 明暗周期，温湿度可控，给予标准饲料和饮用水。

参考文献[7]建立小鼠CPR 模型。2.0%异氟烷麻醉小鼠后行气管插管并连接小动物呼吸机。将外径0.61 mm 的PE 管（SDR Scientific，澳大利亚）插入右颈静脉建立静脉输液通道，通过颈动脉将传导压力-容积导管（SPR-839，Millar Instruments，美国）置入左心室。通过PE 管以氯化钾0.08 mg/g诱导小鼠CA，并将气管插管与呼吸机断开。CA 8 min后重新连接呼吸机，用手指以350～400次/min进行CPR。Sal A 组CPR 后30 s，通过PE 管注射Sal A 15 mg/kg 及肾上腺素0.4 μg/g，Vehicle 组仅给予等体积生理盐水及肾上腺素。ROSC 定义为窦性心律恢复，平均动脉压超过40 mmHg 并持续至少5 min。达到ROSC 或CPR超过5 min，则停止CPR。为防止脱水，给予复苏小鼠皮下注射0.5 mL生理盐水，ROSC 后2 h 拔除呼吸机支持，将小鼠放回饲养笼并予自由进食。对照组小鼠正常喂养，不进行建模。

1.3 CPR后小鼠心功能测定

采用超声心动图（Vevo 2100，VisualSonics，加拿大）评估CPR 后3 h 心脏结构和功能。2%异氟醚麻醉小鼠，在小鼠心率为450～500 次/min 时获取左室长轴和M 型图像，并进行相关测量。左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS）的计算方法参考文献[8]。同时，应用上述Millar 导管监测各组小鼠CPR 后不同时间点血流动力学变化，计算左室收缩功能指标左室压力升高最大速率（dp/dtmax）和左室舒张功能指标左室压力降低最大速率（dp/dtmin）。

1.4 Western blot检测心肌组织炎性因子水平

使用Complete Lysis-M 裂解CPR 后3 h 心脏组织。用BCA 法测定蛋白浓度，取每个样品中等量（50 μg）变性蛋白进行15%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并转移到硝酸纤维素膜。5%脱脂牛奶室温下封闭膜1 h，加入抗白细胞介素（IL）-10、肿瘤坏死因子（TNF）-α抗体，4 ℃孵育过夜，HRP 结合二抗室温孵育1 h，用Gel-Pro Analyzer 4.0 进行定量分析。

1.5 CPR后小鼠生存分析

若CPR 后小鼠自发呼吸及心跳停止，并持续2 min 以上，则确认小鼠死亡。小鼠成功达到ROSC后，计算不同组别小鼠此后72 h 内生存率。

1.6 统计学分析

使用SPSS 23.0 软件对数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示。2 组或多组间比较使用非配对t检验或One-way ANOVA 方差分析。方差分析前先进行方差齐性检验，若各组间方差一致则采用Bonferroni 事后检验，方差不一致则采用Tamhane 事后检验。存活率用Kaplan-Meier 方法评估，组间比较采用Log-rank 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Sal A改善CPR后心肌功能障碍

超声心动图结果显示，Vehicle 组小鼠LVEF和LVFS 明显低于对照组，Sal A 组LVEF 和LVFS明显高于Vehicle 组。见图1、表1。

图1 超声心动图评估各组小鼠心功能情况

表1 各组小鼠心功能比较

2.2 Sal A提高CPR后存活率

Kaplan-Meier 曲线显示，与Vehicle 组（33.3%）相比，Sal A 组（68.7%）在CPR 后72 h 内生存率更高（P＜0.05）。见图2。

图2 各组小鼠CPR后72 h内生存分析

2.3 Sal A改善CPR后血流动力学

血流动力学分析表明，在CPR 后1～3 h，与Vehicle组相比，Sal A 组dp/dtmax[（5 407±298.7）mmHg/s 对（4 100±479.7）mmHg/s]、dp/dtmin[（–5 796±249.6）mmHg/s 对（–3 882±670.7）mmHg/s]均明显改善（P均＜0.01），心输出量水平也明显高于Vehicle 组[（7.0±1.1）mL/min对（3.6±0.9）mL/min，P＜0.01]。见图3。

图3 各组小鼠CPR 3 h内血流动力学监测情况

2.4 Sal A抑制CPR后心肌炎性反应

Western blot 结果显示，与Vehicle 组相比，Sal A组心肌促炎因子TNF-α 明显下调（1.66±0.26 对8.35±0.52，P＜0.01），抗炎因子IL-10 明显上调（6.21±0.47 对2.82±0.17，P＜0.01）。见图4、表2。

图4 各组小鼠心肌组织炎性因子蛋白表达情况

表2 各组小鼠心肌组织炎性因子蛋白表达水平比较

3 讨论

本研究发现，Sal A 通过抑制小鼠心肺复苏后心肌炎性反应，减轻心肌损伤，改善心肺复苏后心功能异常。

CPR 后心肌功能障碍和血流动力学不稳定是生存率低下的主要原因。研究表明，复苏成功后心功能障碍是可逆的，这与急性心力衰竭的失代偿不同[9]。然而，复苏后早期的心输出量不足和外周循环低灌注可使全身性缺血再灌注损伤恶化[10]。在CPR 后早期改善血液循环，可稳定血流动力学并改善生存预后[11]。我们既往研究发现，丹参成分之一丹酚酸B（Sal B）对CPR 后心功能具有保护作用[12]。有文献报道，Sal A 可改善慢性失代偿性心力衰竭[13]，然而，Sal A 对CPR 后心功能障碍的影响尚未有相关研究。本研究表明，在小鼠CPR 模型中，Sal A 能够改善心脏骤停诱发的循环衰竭，这与Sal A 抑制CPR 后心肌炎性反应有关。

CPR 后炎性反应广泛激活，尤其是细胞因子大量释放，在CPR 后发挥重要作用，可导致缺血再灌注损伤和心肌功能障碍。CPR 后大量单核/巨噬细胞和中性粒细胞迁移浸润，伴有大量促炎性因子生成，可激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，在一定程度上抑制炎性反应过度激活[14]。本研究发现，Sal A 可明显减少促炎性因子TNF-α 表达，上调抗炎性因子IL-10 表达，从而抑制CPR 后炎性反应的过度激活。

本研究有一定局限性：（1）实验对象为小鼠，未来研究可应用诸如猪或狗等大型动物，进一步明确Sal A 对CPR 后心功能的保护作用。（2）CPR模型是通过氯化钾利用健康小鼠构建，并没有在心力衰竭或冠状动脉疾病动物模型基础上进行，一定程度上降低了临床相关性。

本研究揭示了Sal A 对CPR 后心功能障碍的保护作用，为改善PCAS 提供了新的治疗策略，未来的研究将以大动物为实验对象，以进一步提高Sal A 治疗的临床转化性。