短期净养系统对带壳牡蛎品质的改善作用

陈林昀，李汴生,2,,*，阮 征,2，李丹丹，钱 江

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640；2.广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室， 广东 广州 510640；3.珠海世通超高压技术应用研究院有限公司，广东 珠海 519000）

牡蛎（生蚝）因其饱满细嫩的肉质和深海特有的滋味而受到广大消费者的青睐，目前常见的处理方法包括热处理、干制处理[1]以及一些新型的处理手段，如超高静压处理[2-4]，然而这些处理方式均存在一些难以解决的弊端，例如牡蛎的洁净度难以保证。若在处理后添加开壳清洗的步骤，则可能造成肉质破碎及微生物再污染，一方面可能导致贮藏过程中感官品质下降、细菌繁殖[5-7]及内源性酶活动造成的腐败[8-9]，另一方面也可能导致致病菌食品安全问题，如急性败血症[10]。因此，在对带壳牡蛎处理前进行短期净养是十分必要的。

在短期净养的过程中，贝类放置于洁净水环境中，通过肉边缘的纤毛来回摆动将水流引入壳内而滤食藻类等微小生物，并向体外排出排泄物，减轻原料污染情况[11]， 甚至可除去贾第鞭毛虫等寄生虫[12]。贝类的净化介质一般有2 种：无污染海域的海水，或通过过滤、杀菌消毒等洁净化处理的海水；复原海水，而净化模式也可分为海区净化、流水净化及循环水净化[13]，其中循环水净化更适合在中小型贝类处理企业中应用，也更符合可持续发展。目前净养系统可通过臭氧、紫外线、氯制剂等进行杀菌消毒[14-15]，可通过添加藻类及藻类替代物进行捕后养殖保持存活率[16]，也可通过脱除剂协助重金属和生物毒素的脱除[13]。研究发现，温度是一个重要的影响因素，Pogoda等[17]证明太平洋长牡蛎（Crassostrea gigas）在较为温暖的夏季养殖，糖原、脂质等物质含量高，表现出更高的生理活性，但Lokmer等[18]发现，较高的环境温度下牡蛎死亡率升高，对应的微生物群丰度更高，主要由弓形杆菌属、弧菌属、发光杆菌属、希瓦氏菌属等主导。除此之外，水体的盐度、污染程度[19-20]等因素也会影响贝类的净养情况。因而，温度、盐度、水流速成为重要的净化工艺参数，贝类的品质也多关注于贝类的存活率、感官特性、风味改良、微生物安全性、生物安全性等品质[13]。目前众多研究开发出各类新型净化系统，大多包括暂养池、水循环装置、水体净化装置（泡沫分离器、生物净化池、紫外消毒机）、温控系统及增氧装置等[21-23]。

牡蛎作为一类常用于生食的水产品，其新鲜程度与感官品质能够直接影响消费者的喜爱程度，人们则更多关注于泥沙等固型颗粒物、微生物含量及感官等。因而，本研究设计了一种一体式短期净养系统，将过滤装置、蛋白泡沫分离装置、紫外杀菌装置及制冷装置等集中于一个净养池中。进一步利用该净养装置对带壳牡蛎进行处理，针对复原海水盐度、水体循环、贝水质量比对带壳牡蛎品质的影响进行单因素试验，并对该系统在短期净养过程中带壳牡蛎品质变化情况进行对比评估，旨在保证带壳牡蛎的感官品质和微生物品质，为短期净养技术应用于牡蛎乃至水产行业提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牡蛎：近江牡蛎（Crassostrea ariakensis），购自台山水产供应市场，要求鲜活带壳样品的长度为（10±1） cm/只、带壳质量为（100±10） g/只，选取外壳紧闭的样品，于2～4 ℃的环境中2 h内送达实验室。

市售袋装海盐（净含量500 g）、泡沫箱（材料为聚丙烯，37 cm×24 cm×21 cm）、蓄冷冰袋 （YM-BD-250 g） 上海裕美事业发展有限公司；包装材料（尼龙复合聚乙烯材料，内容物为蓄冷凝胶，质量250 g）、平板计数琼脂培养基 广州环凯微生物科技有限公司；氯化钠 上海润捷化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

带壳牡蛎短期净养系统为自行研制，其基本构造如图1所示，主要由净养池、水循环装置、水体净化装置和鼓气装置等部分组成。其中，净养池是净养对象与净养介质的装载容器，就本研究而言，净养对象为新鲜带壳牡蛎，可存放于网架（21）上的塑料制镂空净化箱（22）中，净养介质是根据一定盐度配制的复原洁净海水（总蓄水量为800 kg）。污水先通过溢流进水管（10）及池底进水管（11）同时收集净化池中上浮的蛋白泡沫及沉积的泥沙、杂质，伴随臭氧发生器（3）、臭氧曝气管（4）鼓入的臭氧，通过污水抽水泵（12）及污水抽水管（19）一并高速喷入蛋白泡沫分离系统，再通过过滤层（18）（河沙、珍珠沙、水上石等）过滤及紫外杀菌灯（14）杀菌，最终通过循环水抽水泵（15）抽回净化池上端，产生的波浪可将上浮的蛋白泡沫推向另一端的溢流进水管（10）。与此同时，鼓气装置包括臭氧发生装置（3）和空气泵（6），一方面可提供充足的氧气，另一方面可达到水体杀菌净化的功能，自来水出水管（17）可补充水体净化循环损失及蒸发损失，使净化水体容量达到一个动态平衡。

图1 带壳牡蛎短期净养系统Fig. 1 Schematic diagram of temporary cultivation device for oysters

BRT-10YATC盐度计 上海步仁智能科技有限 公司；FX-DZ400单室真空包装机 星火北京包装机械有限公司；XFH-30CA高压灭菌锅 浙江新丰医疗器械有限公司；SW-CJ-1F超净工作台、HN-50BS电热恒温培养箱 邦西仪器科技（上海）有限公司；JK802多路温度测定仪 常州市金艾联电子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 带壳牡蛎短期净养

将自来水经过洁净过滤处理，存储于带壳牡蛎短期净养系统中，加入海盐分别配制成盐质量浓度为0.00、0.85、1.70、2.55、3.40 g/100 mL的洁净复原海水。在不放入样品的情况下，复原海水先通过水循环装置先后进行过滤杂质、分离泡沫、紫外杀菌、制冷、通气等步骤实现多次水体循环，以保证海水各处质量浓度稳定、均一。

选择大小相似、外壳完全封闭的新鲜牡蛎，流水冲洗牡蛎表面，去除泥土等杂质，不进行任何脱壳处理，于10 min内置于净养池中进行净养。本研究针对3 个净养参数进行单因素试验，包括不同洁净复原海水盐度（0.00、0.85、1.70、2.55、3.40 g/100 mL）、是否进行水体循环（即开启循环净化系统，或仅静置于复原海水中）、 不同的贝水质量比（1∶400～1∶22.5），同时以未进行任何处理的样品为对照，针对带壳牡蛎进行存活率、肉质盐度、肉质洁净度及菌落总数测定。

在确定最佳净化工艺之后，将带壳牡蛎置于短期净养装置中贮藏20 d，研究该短期贮藏过程的品质变化，包括带壳牡蛎的存活率、菌落总数及净养环境的水体温度、环境空气温度、水体盐度、水体菌落总数。水体温度保持在（20±2） ℃，根据SC/T 9103—2007《海水养殖水排放要求》及NY 5052—2001《无公害食品 海水养殖用水水质》，臭氧质量浓度保持在0.05～0.10 mg/L， 氨氮质量浓度0.05～0.15 mg/L，亚硝酸盐质量浓 度＜0.1 mg/L。此外，泡沫箱贮藏为处理带壳牡蛎前的一种常见暂存方式，因而选择此方式作为短期净养暂存的对比。在该暂存方式下，带壳牡蛎放置在装有蓄冷冰袋的聚丙烯泡沫箱中贮藏，牡蛎与冰袋质量比为4∶1且冰袋置于牡蛎上部铺平，对短期贮藏过程带壳牡蛎的存活率、菌落总数的变化进行监测，当牡蛎全部死亡（存活率=0%）即结束此对比实验。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 存活率

将处理一定时间的牡蛎取出，仔细观察牡蛎壳的闭合情况：若牡蛎壳紧紧闭合，且无任何缝隙，则牡蛎仍有生理活性，判断其仍存活；若牡蛎轻微开壳但静置1 min后仍恢复闭合状态，也判断其仍存活；若牡蛎久置后仍微微张口，则牡蛎已死亡，不具备生理活性，判断其已死亡。存活率根据下式计算。

1.3.2.2 肉质洁净度

参考Gomes等[24]的定量描述分析感官评定方法，并有所改动：本研究针对带壳牡蛎设定了在贮藏过程中具有代表性的感官描述语（牡蛎壳内表面、牡蛎肉表面、牡蛎裙边洁净度），分别对牡蛎壳内表面、肉表面及裙边洁净度（即无杂质程度）进行考量，分值为7 分制，0 分代表无，1 分代表很弱，2 分代表较弱，3 分代表弱，4 分代表中等，5 分代表强，6 分代表较强，7 分代表很强。分值越高代表洁净度越高，肉质杂质越少。

取短期净养不同时期的带壳牡蛎开壳，置于白瓷盘中，用随机数字对样品进行编号，10 位具有牡蛎感官评定经验的感官评定员进行感官评分，并按顺序记录每项分值。

1.3.2.3 盐度

针对带壳牡蛎，将其开壳，切断黏连在壳内壁的闭壳肌，取出牡蛎肉并打成匀浆，取1 滴过滤后的清液滴于手持盐度计上；针对水体，直接取净养池不同位置的海水滴于手持盐度计上。通过手持盐度计的示数可读出盐度，平行测定3 次。

1.3.2.4 菌落总数

根据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》规定的方法测定。针对带壳牡蛎，保证每次待测带壳牡蛎质量、体积基本相等，测定时将均匀破碎的牡蛎肉用无菌生理盐水配制成1∶10的匀液进行菌落总数测定；针对水体，直接取海水进行菌落总数测定。将平板置于（30±1） ℃的环境下培养（72±3） h，计算得出菌落总数。

1.4 数据处理

每个实验重复3 次以上，平均值及标准差采用Excel 2016软件计算，数据表示为平均值±标准差；采用Origin 8.0软件作图；采用SPSS Statistics 22软件进行单因素方差分析及显著性（P＜0.05）分析。

2 结果与分析

2.1 复原海水盐度对带壳牡蛎品质的影响

保持水体循环，贝水质量比为1∶30，研究复原海水盐度对带壳牡蛎品质的影响。由图2可知，净养24 h后，在一定的复原海水盐度范围内，存活率随着盐度的提高而升高。使用盐度为2.55、3.40 g/100 mL的复原海水净养牡蛎存活率最高（P＜0.05），可保持在98.3%左右；而使用盐度为0.00 g/100 mL的复原海水净养牡蛎存活率最低 （P＜0.05），全部死亡。相对应地，牡蛎的肉质盐度也和海水盐度呈一定的正比关系。将牡蛎净养于盐度为2.55、3.40 g/100 mL的复原海水中，肉质盐度仍能够保持与未处理的牡蛎无显著差异，而净养于其余盐度环境的牡蛎肉质盐度均会有不同程度的显著性下降 （P＜0.05），而净养于盐度为0.00 g/100 mL复原海水中的牡蛎肉质盐度下降最显著（P＜0.05）。

图2 复原海水盐度对净养24 h后牡蛎品质的影响Fig. 2 Effect of reconstituted seawater salinity on the quality of oysters after 24 h of temporary cultivation

感官品质方面，未经处理的牡蛎洁净度低，特别是裙边内部夹杂的泥沙杂质较多，经过24 h的净养，在一定的复原海水盐度范围内，牡蛎壳内表面与肉表面洁净度呈先下降后上升的趋势，而裙边洁净度一直保持上升的趋势。未经净养处理的牡蛎肉质盐度为2.55～3.40 g/100 mL，研究表明，环境盐度的变化会通过渗透压的变化影响牡蛎的生活特性。过低的盐度会抑制牡蛎自身的生理活性，净化过程会由此减慢[13]。这能够解释图2中0.00～1.70 g/100 mL下净养牡蛎存活率和盐度较低，相对应地牡蛎裙边洁净度也较低的现象。Ashton等[25]发现，太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）中的细胞膜完整性和血细胞密度对20 ℃以上的温度及20 g/L 以下的盐度敏感，而7.4 g/L以下的盐度则可能抑制其摄食活动[13]。当盐度降低还发现牡蛎壳肉表面洁净度也保持在较高评分，这可能是因为牡蛎死亡后开壳导致流动水清洗出表面较易除去的杂质，而无法去除裙边内较不易除去的杂质。相反，盐度的提高则可能加速牡蛎活动。Prescott等[26]也发现，暴露于25～35 g/L盐度的养殖环境对美洲牡蛎（Crassostrea virginica）的繁殖更有利，Phuvasate等[27]也发现，盐度为20～30 g/L时长牡蛎中副溶血性弧菌的净化效果优于盐度为10 g/L，而这与牡蛎倍性及大小无关。当环境盐度在适宜的范围内（2.55、3.40 g/100 mL），牡蛎仍有较高的生理活性，能够在净养过程中将杂质渐渐吐出，从而达到净化的效果。此外，盐度也能够影响贝类净养后的风味，例如，当盐度为29 g/L时，C. gigas中鲜味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）、5′-核苷酸含量最高，醛、酮含量显著降低，呋喃含量增加[28]。综合存活率、肉质盐度及洁净度的考量，净养于2.55、3.40 g/100 mL复原海水中的牡蛎品质最佳，但考虑到实际生产成本控制，可选定带壳牡蛎净养的复原海水盐度为2.55 g/100 mL。

2.2 水体循环对带壳牡蛎品质的影响

为了探究水体循环对带壳牡蛎品质的影响，分别针对是否进行水体循环对带壳牡蛎进行短期净养，并以未经处理的样品为对照，复原海水盐度为2.55 g/100 mL，贝水质量比为1∶30。由图3可知，净养24 h后，未进行水体循环时带壳牡蛎存活率为40.2%左右，进行水体循环时带壳牡蛎的存活率显著提高至98.3%左右（P＜0.05），与未处理的牡蛎存活率相比无显著性差异，说明进行水体循环对牡蛎的存活有利。对于肉质盐度，是否进行水体循环对其的影响并不显著，二者相关性较低，但均能够保持在2.55%。在感官品质方面，净养24 h后未进行水体循环的带壳牡蛎虽然相比于未处理的样品壳内表面、肉表面、裙边洁净度均普遍有显著性提高（P＜0.05），但若进行水体循环，各洁净度的提高会更加显著 （P＜0.05）。该结果表明，水体循环是对贝类净化效率有较大影响的环境因素之一。水体循环的净化过程促进牡蛎体内杂质随着排泄物一并排出，若这些污染物无法得到及时处理，可能造成在暂存过程中的二次污染[13]。研究表明，针对牡蛎、文蛤等双壳贝类水产品，肉质净化在10 h内能够完成[29]，净化技术也能够降低活体中贝类毒素的含量[13]。在这方面，水流速则是一个重要指标：水流速过小易造成水体内部溶氧不足，从而影响贝类活动；但过快的水流速则可能扰乱净养系统环境（沉降的杂质可能再悬浮），其他系统（如蛋白分离系统、杀菌系统、检测系统等）也可能没有足够时间对水体进行安全控制[13]。研究表明，将流水交换次数从1 次/h提高至5 次/h能够提高长牡蛎中的大肠杆菌净化效率[30]；对于近江牡蛎，林清等[31]也有类似的发现：水交换率4 次/h 的大肠菌群净化效果相较于2 次/h和8 次/h更为显著。Ramos等[32]评估水再循环率对牡蛎养殖的影响，提出 300 mL/min水流速的牡蛎养殖参数能够得到最佳产量（89.34%）和合格幼虫率（84.09%）。因此，水循环频率及水流速是净养装置中的重要影响因素，针对该方面对牡蛎净养品质的影响仍需要进一步研究。目前有部分研究采用加入流水砂滤、紫外杀菌等净化工艺以保证即食贝类的安全性[22-23]，产品的卫生指标能够达到较高标准，但净化用的海水不循环使用，且换水次数的控制未实现机械化，效率较低。相比而言，净化用水的循环利用减少资源浪费，更能够实现可持续发展目标。但是循环水进化体系对设备整体的要求较高，需要严格监测其中可能积累的有毒代谢产物。为了控制此类产物（如氨氮、亚硝酸盐等），流水能够结合空气泵带入足够的氧气，在水循环过程的同时促进空气循环，从而提高牡蛎的存活率[13]。若氧气供应不足，造成大量氮的积累，硝化过程受阻，形成养殖中水中氨氮和亚硝酸盐含量较高，但由于氨氮的转化速率较快，使得亚硝酸盐的问题最为突出[11]。Powell等[33]研究提出其解决方法，除了鼓泡入充足的氧气之外，还能够混合一定量的臭氧，因为牡蛎排泄物中释放的亚硝酸盐、氨氮会与臭氧发生反应，从而降低其中的亚硝酸盐含量，达到降低牡蛎死亡率的目的。

图3 水体循环对净养24 h后牡蛎品质的影响Fig. 3 Effect of water circulation on the quality of oysters after 24 h of cultivation

2.3 贝水质量比对带壳牡蛎品质的影响

复原海水盐度为2.55 g/100 mL，保持水体循环，研究贝水质量比对带壳牡蛎品质的影响。由图4可知，经过24 h的净养后带壳牡蛎的菌落总数基本能够维持在3.46（lg（CFU/g）），而水体的菌落总数与贝水质量比有一定的正比关系，随着贝水质量比从1∶400上升到1∶22.5，净养24 d后水体的菌落总数从2.67（lg（CFU/g））上升到3.53（lg（CFU/g）），最终基本与牡蛎肉质的菌落总数相似，说明牡蛎在短期净养过程中，自身内部的微生物会转移至水体中，而净养牡蛎的微生物基数越大，转移入水体的微生物总数越大，直至水体与牡蛎的微生物总数相似而达到动态平衡。在此贝水质量比范围内，牡蛎的存活率保持在80%以上，肉质洁净度保持在4.5 分以上，说明短期净养能够保证带壳牡蛎的品质，然而当贝水质量比提高，牡蛎的存活率和洁净度有所下降，这可能是因为净养装置中的产品占比增大，导致单位处理量提高，达到相似净养品质的前提下可能需要更长的净养时间（＞24 h）。因此，为了保证一定的牡蛎净养品质和较慢的菌落上升速率，可选定带壳牡蛎净养的贝水质量比为1∶30，此时水体菌落总数为2.52（lg（CFU/g）），与1∶22.5相比，菌落总数降低72.6%。养殖密度约占养殖篮面积50%可保证商业牡蛎的规模及可接受的存活率（＞70%）[34]。Ramos等[32]评估初始放养密度的影响，发现放养密度为160 条幼虫/mL也能保证太平洋牡蛎产率在90%左右。除此之外，短期净养系统可同时结合水体的杀菌装置，如紫外杀菌装置等。

图4 贝水质量比对净养24 h后牡蛎品质的影响Fig. 4 Effect of oyster-to-seawater ratio on the quality of oysters 24 h of temporary cultivation

2.4 不同暂存过程中带壳牡蛎净养过程中品质变化

为了探究不同暂存过程中带壳牡蛎净养过程中牡蛎品质的变化，保证短期净养系统中复原海水盐度为2.55 g/100 mL、贝水质量比1∶30，同时伴有水体循环。

牡蛎养殖过程需要对其贮藏性和安全性进行品质控制[35-36]。由图5可知，短期净养过程中空气环境温度变化幅度较大，在17.5～21.5 ℃浮动，水体温度的变化趋势与环境空气温度类似，但幅度较小，能够维持在20 ℃上下，而复原海水盐度能够维持在2.55 g/100 mL上下，适宜带壳牡蛎的生存，这与Pogoda等[17]的研究结果类似，太平洋牡蛎在20 ℃左右的环境温度下能够积累更多的糖原、脂质等物质，其生理活性也更高。而由图6可知，放置在短期净养系统中，带壳牡蛎在20 d内菌落总数上升较缓慢，仅由3.39（lg（CFU/g））升高至3.72（lg（CFU/g））， 存活率也能保持在80%以上，适合作为牡蛎捕后运输到加工厂后的一种暂存手段，暂存的牡蛎原料以供后续加工使用。基于泡沫箱和冰袋组合的贮存则是一类较为普遍采用的暂存方式，在这种暂存条件下，带壳牡蛎在6 d内菌落总数即由3.46（lg（CFU/g））上升至 4.04（lg（CFU/g）），存活率在贮藏6 d时迅速降低至0%，这将导致肉中腐败菌的快速繁殖和各类腐败代谢产物的产生[37]。因此，短期净养系统能够有效改善牡蛎的捕后环境，带壳牡蛎的存活期延长87.5%，贮藏5 d时菌落总数降低约0.4（lg（CFU/g））。而在牡蛎存活过程中，由于自身的免疫系统能够正常运作，微生物数量的增长相对来说较为缓慢。类似地，潘澜澜等[23]的净化装置中包括暂养池、水循环装置、水体净化装置、温控装置和增氧装置，在此装置中净化56、32 h后能够有效保证后续虾夷扇贝的低温离水保活运输品质，主要包括存活率提高、微生物生长减缓、糖原消耗降低。包括本研究在内，贝类的净化装置一般都包括过滤系统（以过滤除去贝类吐出的杂质）、蛋白泡沫分离系统（以分离除去上浮的泡沫，保持净养用水的长时间洁净）、供氧系统（以提高净化用水中溶氧量，保证贝类存活）、杀菌系统（以控制水体微生物安全性）等。净化暂养系统的设计需要考虑许多方面的因素，包括：1）水产品的新鲜程度（或存活率）；2）食用安全性（微生物、毒素等）；3）风味（一些杀菌处理可能造成特征风味物质的降解或异味生成[13]）；4）投入成本和可行性（包括占地面积、能源可持续性、后续维护）等。此外，值得注意的是，针对不同的贝类产品，净化要求和目的可能并不相同，例如，蛤蜊等埋栖贝类，影响其品质的污染物可能是泥沙杂质，而针对扇贝等吊养贝类来说则更主要是微生物安全性及风味[13]。而在此类短期净养工艺之后，牡蛎的贮藏还能够与各种保鲜技术进行结合，以延长产品保质期，例如超高压处理[38-39]、气调包装[40]等。

图5 带壳牡蛎净养过程中环境条件的变化Fig. 5 Changes in environmental conditions during temporary cultivation

图6 不同暂存过程中带壳牡蛎品质的变化Fig. 6 Quality change of oysters during temporary cultivation and storage

3 结 论

净养24 h后，在一定的复原海水盐度范围内，随着盐度的提高，牡蛎的存活率、肉质盐度及裙边洁净度保持上升趋势，而壳内表面与肉表面洁净度保持先下降后上升的趋势。盐度为2.55、3.40 g/100 mL的复原海水能够保持98.3%左右的高存活率、2.55 g/100 mL左右的肉质盐度及较高的洁净度。因此可选定带壳牡蛎净养的复原海水盐度为2.55 g/100 mL。净养24 h后，进行水体循环的带壳牡蛎较未进行水体循环的存活率、洁净度较高，但二者肉质盐度差异不明显。因此牡蛎在短期净养的过程中应进行水体循环，可同时伴有过滤装置、蛋白泡沫分离装置、通氧装置等，以除去多余的杂质泡沫，并实现空气循环。净养24 h后，在一定的贝水质量比范围内，随着贝水质量比的提高，水体菌落总数保持上升趋势，而牡蛎菌落总数基本保持不变。因此，为了保证一定的牡蛎净养量和较慢的菌落上升速率，可选定带壳牡蛎净养的贝水质量比为1∶30，同时短期净养系统可结合水体的杀菌装置，如紫外杀菌装置等，此时，菌落上升速率较1∶22.5减慢72.6%。在短期净养过程中，环境温度在17.5～21.5 ℃变化，水体温度的变化幅度较小，保持在20 ℃，复原海水盐度保持在2.55 g/100 mL，适宜带壳牡蛎生存。在此短期净养系统中，带壳牡蛎存活率的下降和菌落总数的上升相比于普通贮藏减慢，能够有效改善牡蛎的捕后环境，延长带壳牡蛎的存活期，延缓菌落总数上升，能有效保持带壳牡蛎的品质。