外源枯草芽孢杆菌对青贮番茄秧中菌群及龙葵素的影响

申小冉赵庆张相伦李川皓赵红波胡悦盛清凯

(1.泰安巴夫巴夫农业科技有限公司，山东 泰安 271000；2.平阴县畜牧兽医局，山东 平阴 250400；3.山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室/农业农村部畜禽生物组学重点实验室，山东 济南 250100；4.山东省农业科学院农作物种质资源研究所，山东 济南 250100)

龙葵素又名茄碱，主要存在于茄科植物(番茄、茄子和马铃薯等)的根、茎、叶及果实中，在百合科、菊科植物中也有发现[1]。作为一种有毒糖苷类生物碱，龙葵素是植物生长过程中的次生代谢物质，由茄啶与葡萄糖、木糖、鼠李糖以及半乳糖形成，其结构与人类的甾体激素如雄激素、雌激素、孕激素等性激素类似。龙葵素常引起家畜及人类食物中毒[2]。随着现代农业的发展，番茄等茄科植物大面积种植。因含有龙葵素等毒性物质，番茄秧、马铃薯秧等常被丢弃，不但浪费资源，而且导致产业链断链，阻碍了循环农业产业的发展。作为一种饲料原料，番茄秧等秸秆可以经青贮后饲用[3，4]。青贮时添加枯草芽孢杆菌、乳酸菌等外源菌[5]，不但能够改变青贮饲料的菌群，而且可以提高青贮质量[6]，但无形中增加饲料生产成本。Lastochkina等[7]报道枯草芽孢杆菌浸泡霉变马铃薯后可以降低其中龙葵素的含量。枯草芽孢杆菌作为一种常用益生菌，对青贮番茄秧中龙葵素的影响尚不清楚。本试验研究了外源枯草芽孢杆菌对青贮番茄秧中菌群及龙葵素的影响，以期为茄科植物的饲料化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

果实青绿时的新鲜番茄秧，由山东省费县胡阳镇农场提供。枯草芽孢杆菌(1×108cfu/g)，由山东省农业科学院畜牧兽医研究所提供。麸皮及呼吸膜塑料袋，市场购买。细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司。pMD18-T Vector试剂盒以及EX TaqHS DNA热启动聚合酶，宝生物工程(大连)有限公司。GenEluteTMGel Extraction Kit胶回收试剂盒，美国Sigma Aldrich公司。植物龙葵素ELISA Kit，武汉默沙克生物科技有限公司。α-茄碱，上海源叶生物科技有限公司。

1.2 试验设计及方法

采用单因素试验设计。将新鲜番茄秧粉碎至粒度0.2～0.4 cm，分为对照组(粉碎的番茄秧)、麸皮组(粉碎的番茄秧＋麸皮)、菌麸组(粉碎的番茄秧＋麸皮＋枯草芽孢杆菌)。麸皮加入量为番茄秧重量的10%，枯草芽孢杆菌制剂加入量为0.1%，混匀后快速装入呼吸膜塑料袋中厌氧发酵。每袋装填1.5 kg，每组8袋。发酵5 d后开袋，进行16SrDNA及龙葵素等指标检测。

精准称取α-茄碱，将其溶于枯草芽孢杆菌含量为1×106cfu/mL的马铃薯培养液中，分装入24个培养瓶中，每瓶100 mL，37℃厌氧培养。培养0、12、24、36 h分别从6个培养瓶中取样，检测培养液中龙葵素的含量。

1.3 16SrDNA克隆、转化和文库构建

1.3.1 DNA提取及PCR扩增 每组取发酵后的番茄秧样品4个，混匀后按试剂盒要求抽提DNA。

利用引物27F/16SF:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R/16SR:5′-GGYTACCTTGTTACGACT T-3′扩增16SrDNA。PCR扩增体系:10×TaqBuffer 2.5μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2.0μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0μL，DNA模板2.0μL，双蒸水补足至25μL。PCR反应条件:94℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，35个循环；72℃终延伸5 min，16℃保存。

1.3.2 PCR产物连接、转化和克隆文库构建 根据pMD18-T Vector试剂盒说明和分子克隆方法连接PCR产物并将连接产物转化到感受态细胞DH5α中。用X-gal/IPTG AMP抗性筛选平板选择具有氨苄抗性的单克隆转化子，提取质粒，通过M13通用引物(正反方向)进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，选取扩增片段大小在1 700bp左右的阳性克隆构建16SrDNA文库。

1.3.3 16S rDNA克隆文库测序及分析 对构建的3个16SrDNA克隆文库中经M13通用引物鉴定后的阳性克隆质粒(每个克隆文库筛选110个阳性克隆子)进行测序。对每个克隆子的正反向测序结果使用DNAStar软件进行拼接，去除载体序列。将序列在Unix系统服务器上进行本地BLAST数据库比对鉴定。

1.4 检测指标及方法

发酵后的番茄秧每袋取样品约100 g，用4层纱布裹包后挤压，将挤压出的发酵液3 000 r/min离心5 min，检测发酵液pH值，根据试剂盒要求测定培养液中龙葵素的含量。

根据BLAST数据库比对结果，计算相应菌种克隆子数所占百分比。

1.5 数据处理

采用SAS(V9.1)软件对数据进行处理，采用ONE-WAY ANOVA进行方差分析，采用Student-Newmnan-Keuls法进行多重比较，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 外源枯草芽孢杆菌对发酵液中龙葵素含量的影响

由表1看出，与对照组相比，麸皮组、菌麸组龙葵素的含量和pH值均显著降低，且菌麸组显著低于麸皮组(P＜0.05)。麸皮组、菌麸组龙葵素的含量分别下降约37%和67%。表明番茄秧添加麸皮后青贮可以降低龙葵素的含量，添加枯草芽孢杆菌可进一步降低龙葵素的含量和pH值。

表1 枯草芽孢杆菌对番茄秧中龙葵素含量和pH值的影响

2.2 外源枯草芽孢杆菌对培养液中龙葵素含量的影响

由表2看出，随着培养时间的延长，枯草芽孢杆菌对培养液中的龙葵素含量均无显著影响(P＞0.05)。

表2 枯草芽孢杆菌对培养液中龙葵素含量的影响 (nmol/L)

2.3 外源枯草芽孢杆菌对青贮番茄秧中菌群的影响

从表3、表4、表5看出，对照组主要菌群为气味沙雷氏菌，麸皮组和菌麸组主要菌种分别为戊糖片球菌和植物乳杆菌。成团泛菌含量由对照组的11%降低至麸皮组中的2.04%、菌麸组的1.45%；对照组中未检测出植物乳杆菌，麸皮组和菌麸组中植物乳杆菌的含量分别为6.12%、27.54%。与对照组相比，麸皮组和菌麸组中番茄秧菌群发生了明显变化。

表3 对照组中的菌群

由表4、表5看出，麸皮组乳杆菌(植物乳杆菌、弯曲乳杆菌、短乳杆菌、乳酸杆菌、棒状乳杆菌亚种、银酸乳杆菌)的含量为42.84%，而菌麸组乳杆菌(植物乳杆菌、弯曲乳杆菌、短乳杆菌、副营养乳杆菌)的含量为57.98%；麸皮组中戊糖片球菌为40.82%，而菌麸组为4.35%。和麸皮组相比，菌麸组的菌群发生了明显变化，表明枯草芽孢杆菌改变了青贮番茄秧中的菌群组成。

表4 麸皮组中的菌群

表5 菌麸组中的菌群

3 讨论与结论

随着番茄、马铃薯等的广泛种植，茄科植物的秸秆利用问题日益突出。目前未见番茄秧青贮的研究报道。本试验中番茄秧与麸皮混贮后，番茄秧菌群发生变动，植物乳杆菌等菌群显著增加，发酵液由中性变为酸性，这与在苜蓿[5]中的研究结果一致。本试验番茄秧与麸皮混贮降低了龙葵素含量，这与马铃薯秧和全株玉米混合青贮可以提高青贮品质的结果相似[3]。推测青贮降低龙葵素含量的机理可能为青贮后番茄秧上植物乳杆菌等乳酸菌[8]厌氧扩繁，在乳酸菌的作用下淀粉、葡萄糖等碳水化合物降解转变为乳酸、乙酸等有机酸，降低发酵液的pH值，酸解龙葵素，从而降低龙葵素的毒性[9，10]。

本试验发现，添加枯草芽孢杆菌后，青贮番茄秧的菌群进一步发生变化，这与枯草芽孢杆菌改变青贮全株青绿玉米菌群结构的结果相似[3，11]，其原因可能在于枯草芽孢杆菌作为一种好氧菌，加快了青贮袋内厌氧环境的形成，促进了植物乳杆菌等乳酸菌的扩繁，抑制了有害菌的生长[12]。本试验发现添加枯草芽孢杆菌也降低了番茄秧中龙葵素的含量，这与枯草芽孢杆菌降低霉变马铃薯龙葵素含量的结果[7]相似，推测其机理可能在于:其一，提高番茄秧上植物乳杆菌等细菌对龙葵素的抵抗能力，促进其扩繁。龙葵素作为一种有毒物质，同时具有抗疟疾、抗炎等功效[13]。植物乳杆菌和融合魏斯氏乳酸菌等土著菌对龙葵素具有一定的抵抗能力[14]。枯草芽孢杆菌可能增强了植物乳杆菌等对龙葵素的抵抗能力，并进一步扩繁，酸解龙葵素。本试验发现菌麸组的乳杆菌含量高于麸皮组，且pH值低于麸皮组。研究表明外源型植物乳杆菌等微生物结合可以降低未成熟番茄中的龙葵素含量及改进其发酵品质[15]。本试验中发现枯草芽孢杆菌对培养液中的龙葵素无影响，表明枯草芽孢杆菌对龙葵素的降解可能通过植物乳杆菌等土著微生物间接发挥作用，而非直接作用，这与枯草芽孢杆菌降低霉变马铃薯龙葵素含量的结果[7]存在差异，原因可能在于菌种不同。其二，可能促进青贮番茄秧中真菌等微生物分泌鼠李糖苷酶等酶，酶解龙葵素[16，17]，这有待进一步研究。龙葵素主要成分为茄碱和卡茄碱两种[17]，本试验只对马铃薯培养液中α-茄碱进行了研究，对于卡茄碱的影响尚不清楚。

本试验表明，添加外源枯草芽孢杆菌有助于降低青贮番茄秧中龙葵素的含量，促进番茄秧的饲料化利用。建议番茄秧青贮时添加外源枯草芽孢杆菌。