花生红衣原花青素的提取工艺及抗氧化活性研究

沈文凤王明清赵传志于丽娜毕洁宋昱江晨孙杰迟晓元

(1.山东省花生研究所，山东 青岛 266100；2.山东省农业科学院农作物种质资源研究所，山东 济南 250100；3.青岛大学，山东 青岛 266071)

花生是重要的经济作物和油料作物，我国产量居世界首位[1]，山东、河南等地为主要种植区[2]。花生种皮也被称为花生红衣，含有丰富的多酚类化合物(如原花青素)，是花生营养价值的重要体现。由于提取成本高、效率低，花生红衣除少量被用于中药外，常被当做废弃料制成动物饲料，直接利用价值低廉[3，4]。原花青素具有抗菌抑菌、抗氧化的作用，可改善关节灵活性、抑制肿瘤、预防脑病变和心血管疾病等[5～9]，也可以降血脂血糖，预防帕金森氏病和阿尔茨海默氏病[10，11]等氮氧相关性疾病。原花青素作为一种绿色安全的天然抗氧化剂，具有广阔的应用前景[12]。

花生红衣中的原花青素由黄烷-3-醇单体聚合为不同分子质量的混合物，根据单体连接键的不同分为A、B型两种原花青素，A型原花青素只存在于少数食物中，如蔓越莓、花生、李子[13，14]，B型原花青素则广泛存在于大部分食物。原花青素在大多数食物中为多聚体，如在蓝莓、葡萄、蔓越莓、草莓中多聚体含量大于75%[15，16]，而研究表明只有低聚体(DP≤3)能被胃肠道完全吸收。由此可见，原花青素在食物中存量虽大，但能被吸收的很少[17]。Karchesy等研究发现，成熟花生红衣中原花青素含量为17%[18]，其中50%为低聚体，所以成熟花生中原花青素具有更高的利用价值，花生红衣的原花青素产品有待于开发。

花生红衣中的原花青素分离纯化方法主要有层析法、溶剂萃取分离法、液相色谱制备法等[19]，提取过程复杂，成本高。大孔树脂具有吸附性强、可再生、解析快、使用寿命长、可回收等优点，在天然产物的分离纯化中得到了广泛应用[20]。不同大孔树脂吸附原花青素存在显著差异[21-25]，因此本研究选用8种不同结构的大孔树脂进行试验比较，优化其吸附条件，得到效率最高的大孔树脂吸附方法，并对不同方法提取的原花青素进行抗氧化活性检测，以期为花生红衣产品的进一步开发提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花生种皮，山东省花生研究所提供；大孔树脂XDA-6、LSA-10、LSA-12、LX-T28、D101、LX-32、LX-180S、LX-17，均为蓝晓科技有限公司惠赠；无水乙醇、甲醇、香草醛、盐酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，SIGMA-ALDRICH)、水杨酸、邻苯三酚、七水合硫酸亚铁等均为分析纯；试验用水为纯水(去离子水)。

1.2 主要仪器与设备

ÄKTA pure层析系统(GE医疗集团)；数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；紫外可见分光光度计(日本SHIMADZU公司)；立式恒温振荡培养箱(德国CRYSTAL公司)；循环水式多用真空泵(上海知信实验仪器技术有限公司)；真空冷冻干燥机(美国SIM公司)；旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 花生红衣原花青素提取液的制备 称取一定质量花生红衣，加入10倍体积纯水，于水浴锅中50℃提取2 h，两层滤纸抽滤即得花生红衣提取液。

1.3.2 大孔树脂的预处理 用无水乙醇浸泡大孔树脂4 h以上，去除微孔中的空气。用纯水冲洗至洗出液无乙醇味，滤干备用[26]。

1.3.3 花生原花青素的定量测定 香草醛-盐酸法[27]:取原花青素样液0.5 mL于试管中，加4%香草醛甲醇溶液3.0 mL混匀，再加入1.5 mL浓盐酸混匀。室温反应15 min，于500 nm处测吸光度。注意避光操作。

1.3.4 大孔树脂静态吸附和洗脱试验 分别称取预处理的不同型号树脂各1.0 g于三角瓶中，加入7.53 mg/mL的花生红衣提取液20.0 mL。于恒温振荡培养箱中25℃振荡24 h后过滤，于500nm处测吸光度，计算吸附率。每个样品做3个平行试验。

过滤后的树脂加入95%乙醇20.0 mL，于恒温振荡培养箱中解析12 h，测定解析液吸光度，计算解析率。

式中:C0、C1、C分别为提取液、解析液、过滤液的浓度，单位均为mg/mL。

1.3.5 大孔树脂动态吸附解析试验 选出的大孔树脂经预处理后准确称量4.0 g，采用湿法装柱。制备一定浓度的样液，控制上样流速，每10mL收集一次流出液，测定其吸光度，当流出液质量浓度为原液浓度的10%时为泄漏点[28]，停止进样。每个样品重复测3次。根据流出液体积与大孔树脂吸附前后溶液浓度差的乘积可计算出动态吸附量，累计动态吸附量可得总吸附量。

(1)上样流速对大孔树脂吸附原花青素的影响:配制1.0 mg/mL的原花青素溶液，以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min的流速上样。收集流出液，测定吸光度，以原花青素吸附量为指标，测定上样流速对大孔树脂吸附原花青素的影响。

(2)上样浓度对大孔树脂吸附原花青素的影响:分别配制1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mg/mL的原花青素溶液，以1.5 mg/mL的流速上样。收集流出液，测定吸光度，以原花青素吸附量为指标，考察上样浓度对大孔树脂吸附原花青素的影响。

(3)纯水洗脱用量的确定:取4.0 g经预处理的大孔树脂装柱并按最佳吸附条件上样吸附，然后用纯水洗柱，流速为1.0 mL/min，将未被吸附的色素及杂质洗掉。分步收集流出液，并测定其吸光度，确定纯水用量。

1.3.6 不同浓度乙醇提取物的抗氧化性检测纯水洗脱后，选择20%、40%、60%乙醇溶液进行逐步洗脱，上样量为2个体积柱[29]，流速设定为1.0 mL/min，得到提取液后旋转蒸发掉多余乙醇，冻干。冻干粉末用于抗氧化活性测定。

(1)羟自由基清除率的测定:取上述提取物稀释液0.25 mL加6 mmol/L FeSO4·7H2O 0.25 mL混合均匀，再加入6 mmol/L H2O20.25 mL和6mmol/L水杨酸0.25 mL混匀后37℃水浴1 h，于510 nm处测吸光度，重复3次。计算羟自由基清除率[30]:

式中:Am为H2O2、FeSO4、样品的吸光度；An为纯水、FeSO4、样品的吸光度；Ap为纯水、FeSO4、H2O2的吸光度。

(2)DPPH自由基清除率的测定:取上述提取物稀释液2.5 mL，加0.2 mmol/L DPPH溶液2.5 mL充分混匀反应30 min，于517 nm处测吸光度，以2.5 mL纯水代替待测液作为空白对照，重复3次。计算DPPH自由基清除率[31]:

式中:Ai为DPPH、样品的吸光度；Aj为无水乙醇、样品的吸光度；A0为无水乙醇、DPPH的吸光度。

(3)超氧阴离子自由基清除率的测定:取上述提取物稀释液0.5 mL加50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.2)缓冲液1.25 mL混匀，25℃水浴20 min，再加入25 mmol/L邻苯三酚0.5 mL，5 min后加入10 mmol/L盐酸0.5 mL混匀，于320 nm处测吸光值，重复3次。计算超氧阴离子自由基清除率[32]:

超氧阴离子清除率(%)＝[1-(Ah-Ak)/Aq]×100 。式中:Ah为Tris-HCl、邻苯三酚、盐酸、样品的吸光度；Ak为Tris-HCl、纯水、盐酸、样品的吸光度；Aq为Tris-HCl、邻苯三酚、盐酸、纯水的吸光度。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel处理数据与作图。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL质量浓度原花青素标准液，香草醛-盐酸法测定其吸光度，绘制出原花青素质量浓度与吸光度的关系曲线，得回归方程y＝0.6669x＋0.0041(x为吸光度，y为原花青素质量浓度，mg/mL)，R2＝0.9997。

图1 原花青素标准曲线

2.2 不同大孔树脂对花生原花青素的静态吸附解析比较

不同型号的大孔树脂空间结构、极性不同，对其吸附能力有着重要影响。大孔树脂的主要吸附作用力是范德华力[29]，即吸附质与吸附剂之间的作用力，吸附质的分子结构和吸附剂合成原料的结构是影响彼此吸附作用的重要因素。本试验选用极性树脂(LX-17)、中极性树脂(LX-32、XDA-6)、弱极性树脂(LSA-10、LSA-12)和非极性树脂(LX-T28、D101、LX-180S)4类8种树脂进行考察，由表1可以看出，吸附率最高的是非极性树脂LX-180S，高达94.98%，其次是中极性树脂LX-32，为94.15%，弱极性树脂LSA-10吸附率最低，仅为52.75%。

表1 不同大孔树脂对花生原花青素的静态吸附、解析比较

解析的实质是吸附的逆过程，根据相似相容原理，95%乙醇强极性溶剂易对原花青素分子产生较强作用力，从而使原花青素从大孔树脂上解析下来[33]。解析率最高的是中极性树脂XDA-6，为98.91%，其次是弱极性树脂LSA-10，为98.47%，非极性树脂LX-180S解析率最低，为81.57%。

树脂LX-180S虽然吸附率最高94.98%，但解析率低，吸附率与解析率乘积为77.48%，而树脂LX-32的吸附率同为94%以上且吸附率与解析率乘积为84.30%，比树脂LX-180S高出6.82个百分点，综上选择中极性树脂LX-32为分离原花青素较适和的大孔树脂。

2.3 大孔树脂动态吸附试验结果

2.3.1 上样流速对大孔树脂吸附量的影响 如图2所示，当柱子流速为0.5 mL/min时，原花青素的吸附量为66.00 mg，随着流速的增大，LX-32树脂对原花青素的吸附量减少，这与马萌[34]、田富林[35]等的研究结果一致。当流速为2.0～2.5 mL/min时吸附量下降速度较快，这是由于流速影响原花青素向大孔树脂内表面扩散，流速过快，导致原花青素分子来不及扩散到树脂内表面，过早发生泄漏，浪费样品。0.5 mL/min时吸附率最高，达到93.40%，但流速过慢，耗时过长，生产效率低；当流速为1.0、1.5 mL/min时，吸附量也比较高，分别为63.92、62.97 mg，吸附效率分别达到88.8%、87.5%，综合考虑选择1.5 mL/min流速为上样流速。

图2 上样流速对大孔树脂吸附量的影响

2.3.2 上样浓度对大孔树脂吸附量的影响 由图3可以看出，当上样浓度为1.0 mg/mL时，大孔树脂对样液中原花青素的吸附量为64.90 mg；随着上样浓度的升高，吸附量呈上升趋势，当上样浓度达到6.0 mg/mL时，吸附量达到最高值311.86 mg，随后急剧下降至7.0 mg/mL时的135.22 mg。上样浓度较低时，随着浓度的增加，原花青素分子与大孔树脂接触面增加，快速进入大孔树脂内部并迅速扩散，吸附量增大。当浓度增加至一定程度时，一方面原花青素分子过多因而降低了每个分子与树脂的吸附面积，阻碍其进入树脂内部，影响了原花青素在大孔树脂内部的扩散；另一方面，浓度的增加导致样液中杂质与原花青素的竞争吸附增加，使大孔树脂的吸附量下降。综上，选择6.0 mg/mL为上样浓度。这与前人[29，36-42]在一定范围内上样浓度与吸附量正相关的研究结果一致。

图3 上样浓度对大孔树脂吸附量的影响

2.3.3 纯水用量对大孔树脂解析率的影响 由图4可以看出，随着纯水用量的增加，流出液的浓度降低，说明随着纯水用量的增加，大孔树脂上没有被吸附的杂质和原花青素逐渐被洗下来，当纯水用量达到110 mL时被充分洗掉，流出液浓度为零。所以，选择纯水用量为110 mL。

图4 纯水用量对大孔树脂解析率的影响

2.4 不同浓度乙醇提取物的抗氧化性

由表2可以看出，3种不同浓度乙醇溶液洗脱提取物的抗氧化活性相差不大，对羟自由基、DPPH自由基、超氧阴离子的清除能力分别为50%～53%、40%～44%、13%～14%。相比之下，40%乙醇洗脱物的羟自由基清除能力稍强一些，60%乙醇洗脱物的DPPH自由基和超氧阴离子清除能力稍强一些。从不同品种花生红衣中提取的原花青素抗氧化性相差很大[43]。本试验结果表明不同浓度乙醇洗脱的同品种同批次花生红衣的原花青素抗氧化性相似。

表2 不同浓度乙醇溶液洗脱提取物的抗氧化活性测定结果 (%)

3 结论

本试验开展了8种大孔树脂的静态吸附试验和动态解析试验，筛选出了分离原花青素的较适树脂LX-32，其最佳吸附工艺条件为:上样流速为1.5 mL/min，样品浓度为6.0 mg/mL。采用20%、40%、60%的乙醇溶液进行洗脱提取试验，3种洗脱提取物中原花青素的抗氧化活性相差不大，对羟自由基、DPPH自由基、超氧阴离子的清除能力分别为50%～53%、40%～44%、13%～14%。