附睾中非编码小RNA（sncRNA）的研究进展

2023-03-05许娇霞张家新何小龙

畜牧与饲料科学 2023年2期

许娇霞，张家新，周璇，何小龙

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010031；2.内蒙古农业大学动物科学学院/内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018）

许娇霞，张家新，周璇，等.附睾中非编码小RNA（sncRNA）的研究进展［J］.畜牧与饲料科学，2023，44（2）：61-65.

精子在睾丸生成后，经附睾头运输到附睾尾的过程中，发生了形态、胞质和细胞核的变化，结构不断完善，最终获得运动能力和受精能力［1］。精子功能上的转化并不是由其内部机制决定的，而是由精子经过附睾所遇到的外在因素所致，即附睾微环境。附睾上皮细胞和精子之间的通讯方式比较特殊，附睾通过主细胞的分泌作用将蛋白、非编码RNA （ncRNA）选择性地积聚到细胞外囊泡中，即附睾小体，而后由附睾小体运送至精子［2］，因此，精子在经过附睾时会被不断修饰进而达以成熟［3］。

ncRNA 是一个庞大而又异质的RNA 家族，它们没有被翻译成蛋白质，以RNA 的形式直接发挥作用，从基因表达调节、基因组防御到表观遗传［4］。ncRNA 在生物领域的多个方面具有重要作用，如在人类肿瘤、非肿瘤等方面的疾病治疗，在动物胚胎发育、肌肉生长、脂肪沉积、免疫应答及皮肤毛囊调控等领域［5］。可根据ncRNA 的大小将其分为两类：>200 nt 的为非编码的长RNA（lncRNA），lncRNA 对转录、剪接、翻译、蛋白质定位、细胞结构完整性、基因组印记、细胞周期和凋亡等重要的生物学过程至关重要［6］；<40 nt 的为非编码小RNA （sncRNA），sncRNA 通常在转录或转录后水平上沉默RNA 来调控基因的表达。sncRNA 不仅可以建立和调节组织自身的基因表达模式，且对于调节精子中父系表观遗传信息及后代的发育也有着至关重要的作用［7］。同时sncRNA 中的微RNA （miRNA）PIWI 蛋白相互作用蛋白（piRNA）、tRNA 源性片段（tRF）及来源于28S rRNA 的新小RNA（rsRNA-28S）在调控雄性生殖方面作用扮演重要角色。到目前为止，研究最多的是miRNA，它在哺乳动物附睾中起关键调控作用，可以与内分泌信号协同调控附睾不同节段的基因差异表达，且高度保守［8］。此外，最新研究表明，sncRNA对基因表达的调控作用以及对精子成熟的影响都远远超过上皮细胞中的稳态基因［2］。鉴于此，该文将对附睾上皮和精子中sncRNA 的调控功能展开论述。

1 附睾

附睾是一条长而弯曲的小管，附睾的上皮组织是由不同类型的细胞组成，包括主细胞、基底细胞、亮细胞、晕细胞和顶细胞，主细胞最多，约占整个附睾管上皮细胞的80%。附睾可根据其节段分为三部分：头、体、尾。在附睾头和附睾体内，主细胞具有蛋白质合成和分泌的能力。附睾每个区域的上皮形态、管腔直径和管腔环境都有所不同，这要归因于特定区域基因的不同表达。Browne 等［9］研究发现，人附睾上的miRNA 可调控附睾的区域化基因的表达和功能。此外，在激素的调节下，不同发育阶段对附睾的组织结构和基因表达也会产生显著的影响［10］。这种严格把控基因的时空表达特性揭示了附睾中有着严格而又多层次的基因调控网络，该网络涉及转录因子、sncRNA 和DNA 甲基化。

在睾丸形成但并未成熟的精子进入附睾后，附睾管腔内环境通过直接分泌或附睾小体运输来介导上皮细胞和精子之间蛋白质或RNA 的转移和交换［11］。附睾小体释放后，与邻近的上皮细胞相互作用，进行旁分泌调节，从而对精子成熟产生间接影响［12］。另外，附睾小体还可以通过向精子传递复杂的蛋白质和脂类对精子的成熟产生更直接的影响，这些相互作用涉及选择性黏附和瞬时融合机制，最终导致精子膜结构和胞质的成分发生显著变化。大多数附睾小体中的蛋白在精子通过附睾过程中转移到精子亚细胞或膜结构域，参与受精能力的获得、运动的调节和氧化应激的保护［13］。而后Gay 等［14］还使用标记硫脲嘧啶渗入法（TU）检测小鼠附睾上新合成RNA 的转移情况，并通过SLAM-Seq 的方法对新合成的RNA 进行了标记和测序，研究结果进一步证实了sncRNA 就是由附睾上皮产生的附睾小体转移至精子上的［2］。在附睾腔环境中，附睾小体可将miRNA［11］、tRF［2］及rsRNA-28S 包裹并携带，从而介导上皮细胞和精子之间sncRNA 的传递作用于精子［11］。

2 附睾中sncRNA 的表达特征

大多数sncRNA 都是通过调控靶基因发挥其功能的。例如miRNA 先是与RNA 诱导的沉默复合体RISC 结合，然后抑制靶基因mRNA 的翻译或者切断碱基配对直接到达3′非翻译区（3′-UTR），从而达到沉默基因的效果。由于miRNA 序列通常不能与靶序列完美互补，因此，每个miRNA 都可能有数百个靶向mRNA［15］，类似的调控机制也被证明适用于piRNA 和tRF。

在人类等物种的附睾中应用微阵列和高通量测序的方法已经鉴定出几百个miRNA 的复杂图谱［10］，其中一些miRNA 显著富集于附睾或是附睾特有的。在小鼠、大鼠和人附睾组织的所有区域中有79 个miRNA（约占所有miRNA 的21%）均具有保守性［8］。据估计在人类和小鼠细胞中，tRF 群体含有150 多个不同序列的tRF，表达量显著高于在同一组织中大多数的miRNA。而且tRF 在附睾尾部的成熟精子中大量积累而成为主要的sncRNA 种群，因此，tRF 在男性生殖健康领域至关重要［16］。而piRNA 在成熟精子的sncRNA 谱中占到17%［17］，这些研究发现提示sncRNA 可能在维持附睾内环境平衡中发挥关键的调节作用。而且sncRNA 发挥作用时对mRNA 的互补性要求低，所以每个sncRNA 都可能调控许多功能上无关靶基因的表达。

哺乳动物附睾中sncRNA 的表达还具有时空性。例如在小鼠［8］、大鼠［18］、人［9］、马的上皮细胞中，miRNA 家族表现出一定程度的区域表达模式。例如在马的附睾头、附睾体近端和远端、附睾尾分别检测到11 个、6 个、8 个、19 个miRNA，这说明附睾区域之间的miRNA 谱存在差异［19］。在某些情况下，miRNA 丰度的节段性变化明显，例如在小鼠中从附睾头到附睾尾miR-204-5p 降低了39 倍，miR-196b-5p 升高了45 倍［8］。miR-573 和miR-155 在人的附睾头大量表达，而在附睾尾miR-1204 和miR-770 大量表达［9］。而且附睾中的miRNA 还会随着年龄的增长而发生变化，例如人的新生儿附睾中miRNA 的表达最高，随着生长发育逐渐降低［10］。Chu 等［7］还对青年小鼠和老年小鼠附睾中的sncRNA 进行了比较，观察到：随着年龄的增长，附睾中miRNA 比例下降，tRF 和piRNA比例增加，因此，sncRNA 在附睾不同节段的差异表达对附睾形成独特的节段性微环境具有重要的调控作用。

为了观测小鼠精子从形成到成熟过程中sncRNA 的变化，Chu 等［7］将睾丸中生精细胞与附睾头和附睾尾中精子的小RNA 图谱进行了整合，发现精子进入附睾后，精子上piRNA 的高比例转变为tRF 和rsRNA-28S 的高比例［20］。精子转录停止的特性，很有可能是这种附睾中sncRNA 含量变化和腔环境相互作用的结果。而附睾尾中成熟的精子存在piRNA 的序列，这一发现揭示了精子在经过附睾时，附睾液中的sncRNA 对其进行了修饰［2，20］。最近Hutcheon 等［17］研究发现piRNA 不同于其他类型的sncRNA，精子尾部上的piRNA并不是从附睾上获得的，因为附睾上并不存在piRNA，而且附睾小体中所包含的piRNA 也很少，因此，附睾和精子的体外共孵不会使得piRNA 的大量转移［2］。所以附睾小体不太可能解释附睾尾部成熟精子中piRNA 的积累。鉴于此，引发了科学家们的另外一种推测，即精子可能含有piRNA前体转录物，用于piRNA 的合成［17］。综上所述，附睾上皮细胞中sncRNAs 的多样性及其表达水平的时空差异会影响许多潜在的靶基因，这些基因在很大程度上与哺乳动物的生理和病理过程有关。

3 sncRNA 对附睾上皮功能的影响

在附睾上皮细胞中，miRNA 占总sncRNA 的最大比例，可调控组织的发育，还参与了附睾节段高度区域化基因表达的建立和维持。例如miR-34和miR-449 可调控附睾输出小管中纤毛的分化，一旦将其敲除，纤毛缺失引发精子凝集、管腔阻塞，最终导致雄性不育［21］。不同物种的附睾中，miRNA 表达的时空性与其靶基因mRNA 的表达呈负相关［10，18］。在人类附睾中，随着年龄的增长，附睾中的miRNA 随着靶向mRNA 的增加而减少［10］。大鼠附睾中的miR-335、miR-29a 和miR-200家族表现出与靶基因RASA1、NASP、TCF8 和CTNNB1 相反的时空表达模式［18］，这些miRNA 主要参与对附睾上皮细胞增殖和附睾发育的调控。此外，miR-200 家族在成年大鼠附睾头上比附睾尾上优先表达。miR-200 家族还有很多功能，例如细胞的抗凋亡作用和蛋白转运［18］。

附睾中的miRNA 也参与应激反应的调控，有研究敲除小鼠附睾头区域Dicer1（一种负责miRNA 成熟的关键酶）后发现，Dicer1 的局部敲除导致上皮细胞去分化、类固醇激素信号和脂质稳态失去平衡［22］，Dicer1 还参与β-防御素基因亚群的转录调控，这些基因是编码附睾抗菌防御系统的关键元素［23］。Zhang 等［24］研究发现，miR-7578 还可以抑制炎症。除了miRNA，附睾中其他的sncRNA对应激反应也有一定的作用。最近研究发现，piRNA 中的PIWI1 和PIWI2 在老年小鼠的附睾中具有很高的表达，通过沉默其附睾头上抗氧化基因GPX5，促发氧化应激使得piRNA 显著下降，继而引起其靶基因表达的升高［25］。此外，还发现在发生感染或炎症时，tRF 和rsRNA-28S 的表达水平也会随之改变，这些研究结果表明sncRNA 参与应激反应［20］。而后续的研究表明，暴露于多种应激环境下的附睾，其精子和附睾小体的sncRNA 分布也会受到影响［26］。

4 sncRNA 对附睾精子功能的影响

附睾miRNA 除了在上皮细胞中调节靶基因表达的原位效应外，还可以通过附睾小体释放到附睾管腔中，然后与其他上皮细胞或精子产生效应。附睾中的一些miRNA 还会选择性地富集在附睾小体上，例如miR-202、miR-204 和miR-1224等［19］。这些附睾小体上携带的miRNA 被证明是细胞间的通信介质，且参与附睾基因表达的旁分泌调节［11］。而当这种附睾通过附睾小体向精子转运的过程受到影响时，例如生殖道炎症，这会影响精子获得tRF 和rsRNA-28S［20］，同样很多研究表明，输精管切除术后逆转和少精子症患者，附睾中附睾小体携带的sncRNA 不进行传递［27］。由此可见，附睾分泌的sncRNA 在医学上也可作为诊断某些雄性生殖疾病的指标。

附睾小体携带着由附睾合成的sncRNA（包括miRNA、tRF 以及rsRNA-28S）转移至经过的精子上，然后精子将这些重要的表观遗传信息传递给合子，参与早期胚胎的调控，并对后代的发育有很大的影响［19］。研究发现，将附睾头的精子与卵子结合后，合子很快死亡，但将附睾尾特定sncRNA 纯化后注射到合子内，可以避免致死，这一研究进一步强调了精子在附睾运输过程中获得sncRNA 重要的生物学意义［28］。父本的代谢异常会影响sncRNA 的含量，尤其是精子中tRF，可通过调节胚胎早期发育的代谢基因表达作为补偿，从而降低父本的代谢异常给后代带来的不利影响［29］。男性生殖道的炎症也会改变成熟精子中的sncRNA，例如tRF 和rsRNA-28S，这可能是一种父本传递给后代的免疫表观遗传信息［20］。

miRNA 在调节精子成熟方面也起到关键的作用。附睾上皮细胞中miRNA 谱在区域差异性表达，而miRNA 还可通过附睾小体从附睾上皮运输到精子，这提示miRNA 不仅参与附睾功能的调控作用，还可调控精子的成熟。经研究发现马附睾尾部的精子多了66 个新获得的miRNA，例如miR-122、miR-388、miR-128 和miR-376a 等，经过预测它们的靶向途径对精子成熟都具有影响作用［19］。研究发现，将雄性小鼠miR-7a2 敲除后，其精子活力低且不育［29］。Ni 等［30］尝试将人工合成的miRNA模拟物（agomir）注射到成年大鼠的附睾尾中，发现这会引起一系列分子变化，如附睾中羧酸酯酶CES7 mRNA 和蛋白的表达显著降低，这些变化导致精子获能缺陷，从而影响了精子的成熟。基于这些研究，通过条件性敲除Dicer1 后，机体丧失生育能力［25］，由此可见miRNA 对精子成熟起着至关重要的作用。