组学技术在红曲霉研究中应用的进展

王昌禄, 王旭锋, 丁成芳, 丁文涛, 郭庆彬

(天津科技大学 食品科学与工程学院/省部共建食品营养与安全国家重点实验室,天津 300457)

红曲霉是一种丝状真菌,将红曲霉接种于大米发酵而成的红曲米在中国及周边国家拥有上千年的食用历史。红曲霉以其丰富的有益代谢产物(如红曲色素、莫纳克林K、γ-氨基丁酸、麦角甾醇和红曲多糖等)[1],在食品、药品及化妆品等工业领域有较大的应用潜力,受到了全球的广泛关注。

分子生物学技术和组学技术的发展,为红曲霉的研究和提高其生产性能提供了有效手段[2]。组学是研究生物体各种组分之间关系的学科,强调从整体的角度出发去研究细胞结构、基因、蛋白及其分子间相互作用,以掌握DNA、RNA、蛋白质和代谢产物的基本状态,从而对生物系统进行全面解读。组学包括基因组学、蛋白质组学、代谢组学、转录组学、脂类组学、免疫组学及糖组学等。目前,已经对十余个红曲霉基因组数据进行了分析和研究,有近百篇与红曲霉生长发育、代谢调控相关的转录组学、蛋白质组学及代谢组学文献作为支撑,为阐明红曲霉的代谢机制提供了有力的数据支持。通过对红曲霉组学技术进行系统阐述,可以帮助人们全面了解组学技术在红曲霉研究和应用中的重要作用。因此,本研究系统阐述了基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等组学技术在红曲霉次级代谢产物研究中的最新进展,以期为进一步开发利用红曲霉基因资源、对红曲霉进行深入研究及其代谢产物的生产和应用提供参考。

1 组学技术在红曲霉研究中应用的热点

以Web of Science(WOS)数据库为例,分析了近20年红曲霉组学研究的文献及其关键词。红曲霉组学研究按研究方法可分为基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学,其中,转录组学文献占比超过45%,是红曲霉组学研究中最常用的技术,表明转录组学在红曲霉研究中占据十分重要地位。此外,多组学联用是近年来红曲霉研究的一个热点趋势,尤其是各组学与转录组学联用的研究,在红曲霉次级代谢产物代谢调控机制分析及新型调控因子挖掘方面发挥关键作用。

通过关键词出现频率对红曲霉研究的热点主题进行了解析,研究最多的红曲霉种类分别为红色红曲霉(Monascusruber)、紫色红曲霉(Monascuspurpureus)和丛毛红曲霉(Monascuspilosus);研究最广泛的次级代谢产物依次为红曲色素(monascus pigments,MPs)、桔霉素(citrinin,Cit)和莫纳克林K(monacolin K,MK),色素和桔霉素是当前研究的热点问题,如何在红曲色素等相关产品生产中控制其安全性仍然是目前红曲霉在食品工业等领域进行应用的主要研究方向之一。

2 组学技术在红曲霉研究中的应用

2.1 基因组学

2.1.1种属进化分析

微生物基因组学已经非常成熟的应用于微生物种群分析、种属间差异和进化地位分析等研究中。Chen等[3]研究了食品加工与安全领域具有代表性的12种丝状真菌,并对它们的tRNA基因分布、密码子使用模式和氨基酸组成等基因组特征进行了比较研究,发现红曲霉与曲霉属亲缘性较近。Houbraken等[4]进一步通过系统发育分析证实了红曲霉基因组序列与曲霉属关系密切。

2.1.2次级代谢基因簇预测及功能解析

通过基因敲除等分子生物学手段,已基本确定了红曲霉3种主要次级代谢产物——MPs、MK及Cit的生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters,BGC)及其合成途径[2]。然而,通过解析不同亚种的红曲霉菌株的基因组及其代谢产物,发现不同菌株之间代谢产物差异较大,且次级代谢产物BGC也发生了明显分化[5],这表明红曲霉基因组差异是代谢产物多样化的重要原因之一。研究者分别从基因组学的角度进一步补充和丰富了MPs合成代谢的基因簇功能及代谢调控因子[6-7]。Dai等[8]利用基因组学解析了4株红曲霉MK合成相关基因在BGC上的差异,发现M.pilosusYDJ-1菌株缺失部分基因。同时,与土曲霉洛伐他汀(lovastatin,LOV)基因簇相比,红曲霉MK的BGC规模较小。随着更多红曲霉基因组被测序[9-10],研究者发现MPs、MK和Cit的合成基因簇在种间存在普遍的基因丢失事件,其中Cit基因簇的丢失最为严重[10]。此外,Liu等[11]根据生物合成基因簇分布和系统发育结果,建立了一个新的分类系统,将26个红曲霉菌株划分为A、B和C三大类,其中B类是Cit缺陷菌株,遗传上不能合成Cit。此外,研究还发现,MK和Cit在基因表达上似乎是互斥的。而A类中一株红曲霉(M.sanguineus)同时缺失Cit和MK合成能力,为MPs菌株的选育提供了参考。因此,红曲霉次级代谢产物BGC的丢失在红曲霉进化中广泛存在,可能是营养和能量竞争的适应性选择。

越来越多的研究者通过比较泛基因组学方法分析了不同菌株MPs的合成和代谢的差异,同时,预测和解析了大量与MPs合成相关的基因[5,12-13]。此外,基因组学常用于挖掘潜在的候选功能基因,探究其对红曲霉生长发育和次级代谢产物合成的影响[6,14]。基因组序列分析大大促进了红曲霉种属进化解析、次级代谢产物调控以及功能基因挖掘工作,可加深对红曲霉遗传和代谢的认识,有助于选育高产和更加安全稳定的MPs等代谢产物有关的红曲霉工业菌株。

2.2 转录组学

2.2.1基因簇的边界校准

红曲霉色素BGC基因图谱已经基本确定,但由于不同菌株之间基因簇的基因存在缺失、突变等复杂特性,导致单独使用基因组学分析在BGC功能预测中通常存在偏差。Liu等[15]采用计算分析和转录组分析相结合的方法来预测红曲霉M7中MPs的BGC分布,结合基因敲除验证预测结果,发现BGC由16个基因组成,从mrpigA延伸到mrpigP,外侧较近区域的基因不属于BGC的范围。由此可见,单纯的基因组生物信息学预测不能完整展现真实BGC,引入转录组学数据校准基因组预测结果可以更准确地确定次级代谢产物BGC的真实边界。

2.2.2微生物互作关系分析

由红曲霉和黑曲霉等共发酵获得红曲米的生产方式已经持续了上千年,但对红曲米中共生微生物相互影响的作用机制尚未被有效证实。转录组学是当前从分子水平解析微生物代谢调控机制的常用手段之一,转录组学的特性要求其追求样本较高的纯净度,而从混合菌种样品中分离出单独的转录本几乎不可实现。Yuan等[16]巧妙设计了双面细胞培养皿(double-sided petri dish,DSPD),研究了红曲霉和黑曲霉自然共培养现象,发现二者是共生而非拮抗关系,且红曲霉可促进黑曲霉孢子的生成,黑曲霉可以影响红曲霉胞内、外MPs的种类。DSPD方法通过物理隔离方式克服了真菌共培养研究中的真菌生长速度不同、样品分离困难等问题,成功获得了两种曲霉的转录本。遗憾的是,尚未见关于该研究中由转录组学数据对二者作用机制探讨的报道。DSPD方法展现了其在研究微生物相互作用,特别是揭示了真菌间相互作用的潜在价值。

2.2.3环境因子及其代谢调控机制分析

2.2.3.1 化学调控因子

培养基组分作为微生物所需的营养成分,可为红曲霉生长发育、次级代谢产物的合成提供必要的物质和能量来源,同时,在一定条件下也是一种环境刺激信号,参与红曲霉各项生命活动的调节。已报道的对红曲霉次级代谢产物合成有显著调节作用的营养成分有单糖、淀粉、甘油等碳源,氨及铵盐、硝酸盐、蛋白胨等氮源。研究表明,糖酵解、丙酮酸代谢及三羧酸循环为MPs等次级代谢产物的合成提供了前体物质——乙酰辅酶A和丙酰辅酶A[7,17-18],而氮代谢过程也可直接或间接连接到三羧酸循环关键代谢环节[19],三羧酸循环是关联初级代谢和次级代谢的关键枢纽。通过调节碳源的比例抑制中心碳代谢可以增加乙酰辅酶A库,有助于提高MPs的产量[12]。而琥珀酸是三羧酸循环的中间产物,外源添加琥珀酸可显著下调红曲霉脂肪酸生物合成相关基因的表达,同时上调丙酮酸代谢相关基因的表达。通过对乙酰辅酶A生物合成代谢途径的竞争调节,进而提高MPs的产量[20]。此外,适当的氮源种类和水平不仅可以促进MPs的合成,而且还可以减少Cit的含量。深层发酵中以NH4Cl或NH4NO3为唯一氮源可显著提高MPs(尤其是橙色素和红色素)的产量并降低Cit的含量。转录组学表明,无机氮源可通过促进MPs前体的合成、降低Cit聚酮合酶的转录水平,降低Cit的合成[21]。而硝酸盐通过上调mpigsA、mpigsH、mpigsK、mpigsL和mpigsP基因的表达,促进亲水性黄色MPs的生物合成[22]。转录组学结合蛋白组学分析表明,这可能是MPs生物合成途径(碳分解代谢、氨基酸代谢、聚酮合成和脂肪酸代谢)和分泌相关(细胞膜麦角甾醇生物合成和转运)通路的上调表达共同作用的结果。

2.2.3.2 物理调控因子

光是调节真菌各种生理过程的重要环境因子。研究表明,红光、绿光和蓝光均可影响红曲霉的生长发育和代谢活动。已经在红曲霉中发现了红光和绿光的受体蛋白,但目前尚未发现蓝光蛋白。然而,转录组学研究表明,低剂量蓝光通过上调芳香族氨基酸和支链氨基酸降解途径、脂肪酸的β-氧化等途径,可促进MPs生物合成前体(乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A)及能量(ATP和NADH)的供应,进而促进MPs的合成。而在高剂量蓝光条件下会诱导红曲霉分生孢子生长,体现对蓝光诱导的应激防御[23]。这些结果表明,红曲霉中可能存在与粗糙脉孢霉完全不同的蓝光受体[24],需要进一步的研究。

静磁场(static magnetic field,SMF)可提高红曲霉初级代谢相关基因的转录水平,同时影响MPs、Cit和麦角甾醇生物合成途径中相关基因的转录。转录组学分析表明,这种作用与有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路相关基因的转录密切相关。SMF通过MAPK信号通路,影响信息素应答通路、细胞壁完整性通路、高渗透压通路和丝状生长通路中大多数基因的转录水平,通过MAPK级联的顺序激活来激活下游转录因子,将SMF刺激与广泛的细胞反应联系起来[25]。已有研究表明,蓝光和SMF或存在协同调控作用[26],而转录组学分析表明,MAPK信号通路显著影响了二者作为环境信号的刺激应答[24-25],这或许有助于新型蓝光受体的挖掘和验证。

2.2.3.3 生长发育调控因子

真菌多糖是构成真菌细胞壁的重要组分,在生长发育、维持细胞稳态、抵抗不良环境及控制物质转运等方面发挥了重要作用。几丁质是红曲霉细胞壁的重要组分,研究表明,缺失几丁质合成酶基因VI(chs6)可导致红曲霉气生菌丝短而稀疏,进而显著降低活性孢子的发芽率,同时增加其对环境的敏感性[27]。比较转录组学发现,与孢子发育和生长相关的途径(包括MAPK信号途径、几丁质生物合成途径以及调节因子LaeA和WetA)在发酵早期显著下调,Cit等次级代谢产物的生物合成相关的基因表达也显著下调。Xie等[28]利用比较转录组学探讨了红曲霉胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)的生物合成机制,结果显示,17种关键酶与EPS合成有关;与发酵2 d组相比,发酵4 d组差异表达基因主要集中在12个碳水化合物代谢亚类;但随着发酵时间的延长,只有9个碳水化合物代谢子类中发生了富集,表明红曲霉EPS的生物合成主要发生在碳水化合物代谢过程中。这些研究为红曲霉中基于多糖的细胞生长和发育的研究提供了基因水平的重要参考。

2.2.4新转录调控因子的挖掘

得益于组学高通量测序和通路注释,近年来在红曲霉中相继发现了许多新的转录调控因子。如酵母蛋白转运子、ATP柠檬酸裂解酶、G蛋白亚基、MAPK、群体感应分子、促分裂素原活化蛋白激酶等。

酵母蛋白转运子(yeast protein transports,Ypts),也称为Ras相关结合GTPases(Rab),是小GTPases家族中最大的一组,已在真核细胞模型中被广泛研究,并在膜转运中发挥关键作用。红曲霉中,Ypts同源基因mrypt7的缺失会导致菌丝径向生长速度减慢、细胞内次级代谢产物的产量显著增加。转录组学进一步表明,红曲霉中MRYPT7蛋白可与许多参与红曲霉M7生长、分生孢子发生、次生代谢生物合成和运输的基因相协调。结合Ypt7同源物对其他真菌的类似作用,推测Ypt7是真菌中的一个全局调控因子[29]。

ATP柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)在乙酰辅酶A的形成中起着关键作用,乙酰辅酶A是MPs生物合成的关键前体。Long等[30]研究了acl1和acl2基因,通过过表达acl1和acl2显著增加ACL活性,导致乙酰辅酶A水平升高,并显著提高了MPs总产量。转录组学测序分析表明,MPs合成过程中乙酰CoA和红色MPs胺化过程中NH3的代谢通量密切相关,即ACL通过调节碳代谢和氨基酸代谢来调节红曲霉MPs的合成。

异源三聚体G蛋白信号通路参与调节真菌的多种生物过程。Lei等[31]研究了红曲霉M7 G蛋白3个α-亚基的功能。结合单基因和双基因敲除及其转录组学数据,系统地分析和比较了Mga1～3的作用。研究表明,所有3个G蛋白α-亚基共同调节红曲霉M7的生物过程,其中Mga1起主要作用,而Mga2和Mga3起补充作用。这些研究有助于深入了解不同G蛋白α-亚基对丝状真菌生长、发育和次生代谢的影响。

MAPK是真核生物信号传递网络中的重要途径之一,调节着细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理和病理过程,在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用。在红曲霉次级代谢产物合成调控中,已有多种代谢调控模型指向MAPK信号转导途径,例如红曲霉响应蓝光[23]和磁场信号[25]刺激触发的转录调控。在较高强度的信号刺激时,可能通过触发MAPK信号通路,进而提高多种次级代谢相关基因的转录水平,调控MPs、Cit等次级代谢产物的合成。然而,目前红曲霉中完成触发MAPK信号通路的感应分子尚未被发现,MAPK信号通路末端直接参与调控次级代谢基因簇转录表达的受体因子也未被证实。因此,红曲霉中MAPK信号通路的精细调控机制还需要进一步的实验验证。

群体感应(quorum sensing,QS)可调节丝状真菌的菌丝体发育和次级代谢。在红曲霉中,γ-丁内酯可显著影响生长和菌丝形态,促进MPs和MK的合成[32]。转录组学分析表明,γ-丁内酯与细胞生长、膜结构和能量代谢等途径密切相关,表明γ-丁内酯在红曲霉生长代谢中起QS分子的作用,并可能通过调节与细胞发育、次级代谢产物合成和能量代谢相关的基因的转录表达,进而影响红曲霉的形态和次级代谢。

沉默信息调节因子2(silence information regulator 2,Sir2)家族是一类保守的去乙酰化酶蛋白家族,广泛存在于多种生物中,具有依赖NAD+的去乙酰化酶和ADP-核糖转移酶活性。Sir2在染色质沉默、基因调控、代谢调节和细胞寿命调节等众多生命活动中发挥着重要作用。在红曲霉中,缺失mrsir2(sir2同源基因)的菌株在生长阶段积累了更多组蛋白H3亚基的乙酰化赖氨酸残基,表明其主要针对生长阶段的H3亚基。此外,缺陷菌株菌丝过早老化,产生更多的孢子和次级代谢产物,并增强氧化应激。转录组学分析表明,MrSir2主要调节大分子代谢(如碳水化合物、蛋白质和核苷酸)中的基因表达以及编码细胞壁合成和细胞膜成分的基因,表明MrSir2可能促进从最初生长阶段到菌丝体衰老的代谢转变[33]。

NADH-泛醌氧化还原酶核心亚基S8(NADH-ubiquinone oxidoreductase core subunit S8,NDUFS8)负责NADH氧化、泛醌还原和从线粒体中释放质子。红曲霉次级代谢产物的合成代谢与辅因子代谢密切相关。下调ndufs8表达,影响菌体形态及次级代谢产物的合成,还显著地抑制呼吸复合物I、III及超氧化物歧化酶的酶活性,导致活性氧(ROS)水平升高和ATP浓度降低。转录组学进一步证实其参与呼吸链、三羧酸循环和脂肪酸降解等过程,同时,MPs和Cit基因表达水平显著提高。因此,证实呼吸复合物I通过改变细胞内ROS和ATP水平,参与红曲霉的细胞生长和次级代谢等重要生命活动[34]。

转录组学是红曲霉代谢调控研究中使用最广泛、最成功的组学技术,在基因及基因簇校准、代谢调控机制解析、调控因子的挖掘等方面发挥重要作用。此外,转录组学与其他组学的联合使用,可以弥补单一组学的不足,并通过交互作用实现更精确地预测转录表达结果,从而全面地解释生物学问题。

2.3 蛋白质组学

2.3.1关键酶等蛋白功能分析

蛋白质是体现生物学功能的最终载体,并且,作为调节因子的蛋白质在微生物生长发育、代谢调控等过程中发挥着重要作用。蛋白质组学的运用为解析蛋白质间的互作关系、揭示代谢调控机制提供了有效方法。近年来,随着双向凝胶电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)、串联质谱(MS/MS)进行蛋白质组学分析、数据库应用及分子生物学技术等的发展,为红曲霉代谢调控中的蛋白质分析和鉴定提供了有效手段,如MrflbA和Erg4蛋白功能的解析。mrflbA是一种G蛋白α-亚基的调节因子,其敲除后导致菌丝体自溶,MPs沉着减少,真菌毒素产量降低,抗氧化酶和几丁质酶活性升高。此外,mrflbA的缺失导致次级代谢产物(MPs和真菌毒素)的转录减少[35]。麦角甾醇合成酶(ERG4)基因Erg4的缺失降低了麦角甾醇浓度,并显著提高了胞外MPs的产量。蛋白质组学分析表明,ERG4缺陷菌株促进了MPs的跨膜转运,即细胞膜组分的转变是促进MPs跨膜转运的重要原因之一[36]。

2.3.2代谢途径及代谢机制分析

为解析碳源调控红曲霉代谢的作用机制,许多学者利用蛋白质组学技术对其进行了深入研究,提出了一系列调控理论,丰富和完善了红曲霉次级代谢产物的调控机制。大米粉是红曲霉发酵常用的碳源,与乳糖相比,红曲霉细胞生长、红色MPs的合成对大米粉缺乏的限制较为敏感。比较蛋白质组学分析表明,二者共有12种差异蛋白质,参与糖酵解、三羧酸(tricarboxylic acid,TCA)循环、能量产生、蛋白质折叠和肽生物合成等过程[37]。因此,推测来源于淀粉代谢的能量供应或许是限制红曲红胺合成的原因。然而,目前由橙色MPs到红色MPs的合成一般认为是一个化学过程,环境中存在氨或者含氨基化合物可与MPs前体自主完成结合。因此,红色MPs合成的减少,可能更多受制于前体物质的合成。以可溶性淀粉和甘油分别作为碳源,其MPs产量差异显著,比较蛋白质组学分析表明,差异蛋白包括核糖体蛋白、热休克蛋白等9个蛋白表达下调[17]。乙醇对红曲霉生长和代谢调控的影响与支链氨基酸降解和乙醛脱氢酶表达水平有关,同时,热休克反应相关的蛋白质的表达也被诱导。此外,乙醇处理可抑制聚酮合成代谢相关蛋白、脂肪酸合成酶、环氧化物水解酶和莽草酸代谢途径相关蛋白的表达[38]。这些结果表明,不同碳源对红曲霉生长和次级代谢的调控非常复杂,此外,MPs的合成调控与初级代谢中蛋白质的表达水平密切相关。

氮源方面,无机氮源硝酸盐可促进亲水性黄色MPs合成,主要是影响非核糖体肽合成酶、氧化还原酶、葡糖淀粉酶、内-1,4-β-羟化酶、O-乙酰基高丝氨酸和异柠檬酸裂解酶等蛋白质的表达[22]。同时,细胞膜麦角甾醇生物合成和转运分泌相关途径也被显著调节,以促进MPs的跨膜转运。氮源缺乏对红色MPs合成的影响更大,氮源受限时,红色MPs合成被显著抑制,参与代谢调控的蛋白涉及氨基酸生物合成、蛋白质翻译、抗氧化相关酶、糖酵解和转录调控等过程。这表明,氮源受到限制将诱导代谢流从糖酵解转换为TCA循环,以维持细胞能量稳态,并抑制用于红色MPs生产的聚酮生物合成途径[39]。当细胞受到高浓度氮源胁迫时,几丁质和糖蛋白的合成将受到限制,导致细胞壁完整性降低,从而抑制细胞生长。此时,红曲霉细胞开启细胞保护机制,通过促进海藻糖合成、谷胱甘肽/谷胱甘肽氧还蛋白系统,维持细胞内氧化还原状态,减少细胞的损伤。同时,与NADH脱氢酶相关的呼吸途径被激活,以平衡物质和能量代谢[40]。

相似的结论也出现在磷酸盐缺乏的例子中,研究显示,磷酸盐的缺乏会抑制红曲霉红色MPs的产生,通过蛋白质组学分析、数据库比对以及相关蛋白质鉴定等手段,发现磷酸盐缺乏的限制涉及的蛋白主要在糖酵解、能量代谢以及其他初级代谢等过程中。在发酵过程中,磷缺乏可诱导醛脱氢酶和糖酵解相关酶的上调表达,而葡萄糖胺:果糖-6-磷酸氨基转移酶和ADP-核糖基化因子1等代谢酶的表达则被抑制[41]。因此,在相对稳定环境中,碳、氮、磷等营养素可在一定程度上影响次级代谢产物的产量,但在恶劣环境中,生存策略促使细胞重新进行物质和能量平衡,抑制代谢过程及生长发育以维持细胞稳态。

红曲霉次级代谢产物的代谢调控机制相当复杂,蛋白质组学的运用促进了越来越多的功能蛋白的挖掘和鉴定。同时,蛋白质组学与转录组学、代谢组学等组学的联合使用是当前组学研究的有效手段,可以弥补单一蛋白质组学研究的不足。

2.4 代谢组学

2.4.1红曲霉代谢产物解析

代谢组学的研究主要基于代谢产物谱的分析和差异代谢产物向代谢途径的映射,即对影响代谢产物合成的代谢途径进行解析。通过色谱和质谱技术的联合使用,大量红曲霉合成的代谢产物被检测和验证。已知的红曲霉代谢产物超过800种,含氨基酸和胺、有机酸、糖和糖醇[42]、酯类、烷类和聚酮化合物[43]、乙醇、绿原酸盐、甘胆酸盐[44]、维生素和辅酶及核苷酸[45]等。红曲霉代谢产生的3类主要次级代谢产物MPs、MK和Cit都属于聚酮类化合物,具有相同的合成前体(乙酰辅酶A和丙酰辅酶A)及类似的合成途径。其中,MPs具有种类多样的结构类似物和衍生物,目前已知的MPs种类超过50种。此外,红曲霉还可以代谢产生多糖[46]、γ-氨基丁酸、二甲苯酸、类黄酮、植物甾醇及不饱和脂肪酸等生物活性化合物[2]。

2.4.2红曲霉代谢途径解析

MPs的生产中往往伴随着Cit的产生,为MPs在食品工业中的应用带来了风险。敲除Cit的BGC中基因pksCT[42]或添加外源诱导物(如染料木素)可以降低Cit的合成[44,47]。代谢组学分析表明,与Cit降低相关的差异代谢产物主要分布在氨基酸代谢途径、糖酵解、丙酮酸合成及三羧酸循环等途径。这些研究为MPs生产中Cit的代谢调控提供了重要依据,但这些代谢途径广泛参与红曲霉的生长、发育等重要生命活动,使得平衡生长和次级代谢控制变得复杂。在MPs生产中,直接敲除Cit的BGC似乎是更方便、经济的方式。

Zhang等[43]探究了谷氨酸对MK合成的影响,结合代谢组学分析发现,差异代谢产物与TCA循环关系密切。进一步通过外源添加柠檬酸(TCA循环中间产物)研究了其对MK合成的影响。这为MK生产中培养基优化及MK高产菌株的代谢工程改造提供了参考。

Li等[48]探究了普洱茶提取物对MPs合成的影响,并对调控MPs合成机制进行了解析。茶提取物可促进MPs的合成,代谢组学结合转录组学分析表明,茶提取物对MPs的合成调控主要通过影响初级代谢途径而实现,并为次级代谢提供充足的能量和更多的生物合成前体。MPs是由红色MPs、黄色MPs和橙色MPs组成的混合色素,如何提高单一MPs的产率也是业界关注的重要问题之一。Liu等[49]利用比较代谢组学进行研究发现,黄色MPs生产中(氯化铵和蛋白胨作为氮源)的差异代谢产物与葡萄糖、乳酸及磷酸戊糖途径密切相关。进一步通过发酵试验验证了这些标记物和代谢途径的作用,发现磷酸戊糖途径作为“开关”在黄色MPs合成中发挥重要作用。然而,MPs合成调控是复杂多样的。Huang等[45]在探究不同氮源与MPs合成类型的关系研究中发现,在代谢水平上,红色MPs合成与胞内氨基酸含量密切相关,而橙色和黄色MPs与核苷酸相关。此外,转录组学分析表明,多个初级代谢途径与红色MPs的合成密切相关,而橙色MPs与次级代谢途径有关,黄色MPs与其他代谢途径的调节有关。这表明MPs的多样性在代谢组学和转录组学水平上受到联合调节,这使得单一MPs生产中的代谢调控变得困难。因此,在单一MPs生产中,得到MPs最大化产率/比例的目标代谢产物是最理想的选择。

3 总结与展望

微生物组学技术大大推动了对红曲霉研究的进程,极大地拓展了人们对红曲霉生长发育、代谢产物合成及代谢调控的认知。在红曲霉中,基因组学主要用于探讨红曲霉的进化地位分析、基因簇的预测和挖掘、同源基因的比对分析及代谢途径分析等研究;利用转录组学研究红曲霉生长和代谢过程中基因或基因簇的转录表达分析、环境适应代谢机制以及新转录调控因子的预测和挖掘;蛋白质组学主要涉及代谢过程中重要酶类的功能解析和总体的代谢调控机制的解析;而代谢组学则用于在代谢产物水平上阐述整体的代谢过程。

通过多年研究,已经掌握了红曲霉三类主要代谢产物MPs、MK和Cit的合成途径,但红曲霉次级代谢产物的代谢调控变化多样,容易受环境因子的影响,因此,还需要深入研究各种环境因子(如碳氮源、光照、磁场等)对红曲霉生长发育和代谢产物合成的作用机制。MPs是组学研究中最热门的主题之一,采用高通量测序等菌种选育技巧、培养基组分优化、化学和物理调节及菌株的代谢改造等手段,围绕高产MPs的调控、特定MPs组分的精细调节、胞外MPs的分泌调控及降低Cit的调控等方面,不断发挥组学技术的作用,为MPs的高效、精准、安全生产做出贡献。

目前,在红曲色素的研究中被广泛采纳的观点是,MPs的合成与碳代谢和氨基酸代谢等代谢途径密切相关,因为MPs的从头合成依赖于这些过程中提供的前体(乙酰-CoA和丙酰-CoA)和能量供应。然而,由于不同MPs共享相同的从头合成过程,丰富的前体和充足的能量并不能将不同MPs进行精准控制。以黄色MPs为例,尽管可以通过筛选黄色MPs突变株或细胞壁表面修饰促进胞外黄色MPs的高效积累[50-51],但橙色MPs和黄色MPs分别由mppG和mppE两个基因单独调控合成[52],调节二者表达的分子开关尚未被证实。此外,胞外MPs的合成一定程度上受制于细胞膜和细胞壁转运的限制,这些细胞屏障的解除可促进MPs等代谢产物的分泌,提高胞外MPs的产量。但由于细胞壁和细胞膜是细胞最外层的保护性结构,其对环境的刺激信号相对敏感。MAPK信号通路广泛存在于真核生物中,作为对外界信号的适应性反应,广泛参与生物的代谢调控过程[53]。作为对不良环境的响应,红曲霉也通过可触发MAPK信号的传导过程调控MPs的合成[23,25]。因此,MPs的合成可认为是红曲霉对环境适应的一种自我保护措施。尽管已有研究通过转录组学解析出红曲霉存在MAPK信号调控过程,但其关键信号蛋白及受体调节因子还有待通过分子生物学手段进一步鉴定,其参与次级代谢产物合成的精细调控过程还有待通过组学技术进行解析和完善。

近年来,通过多组学的联合使用来揭示红曲霉代谢调控机制的研究趋势更加明显,也使得分析结果更加精准可靠。可以预期,微生物组学技术将在红曲霉未来研究和代谢产物工业化生产中继续发挥重要作用,推动红曲霉相关产业可持续发展。