海藻糖对大米淀粉回生特性的影响

刘 微, 杜秉健, 孙京超, 张龙振, 臧 鹏

(中国航天员科研训练中心 航天营养与食品工程重点实验室,北京 100094)

大米是世界上种植最广泛,消费量最大的粮食作物之一。随着人们生活节奏的加快和消费水平的提高,消费者对米饭的方便性提出了新的需求,因此方便米饭应运而生。大米加工后出现的淀粉回生问题,特别是长期回生对方便米饭类产品储存后期的品质有重要的影响。大米淀粉的回生是糊化后的大米淀粉分子链形成的双螺旋结构趋于有序化形成晶体的过程,导致了米饭在加工和储藏过程中出现变硬、干缩等问题,严重影响了米饭的口感和复水性[1],是限制方便米饭产业发展的瓶颈问题。

在安全天然的框架下解决淀粉的回生问题是国内外学者关注的热点。亲水胶体家族及小分子糖类因其较好的持水性被应用在食品体系中以改善体系原本的流变和质构特性[2]。海藻糖作为一种二糖,对人体内生物细胞具有明显的保护作用[3],其潜在的抗淀粉回生的价值近年来也开始受到学者的关注。研究认为,海藻糖的添加能够提高淀粉分子附近水分子的数量,淀粉链与链之间被更多的水分子镶嵌后,淀粉分子链周围的黏度也会提高,改善淀粉的回生现象[4]。Yang等[5]系统探究了海藻酸钠对大米淀粉糊化、流变和回生性能的影响,发现高浓度的海藻酸钠可与大米淀粉通过氢键链接,从而显著延迟大米淀粉的回生进程。Xu等[6]在一项淀粉-海藻酸钠对荞麦面条的品质影响研究中同样证实了海藻酸钠可以降低荞麦淀粉的结晶度与淀粉凝胶网络连续性,同时也提升了荞麦面条的抗消化能力。杨锴[7]通过海藻酸钠能够抑制大米淀粉的老化,增强大米淀粉凝胶结构的韧弹性与稳定性的特点,将其用于改善米发糕的质构和食用品质。但海藻糖抗大米淀粉回生的机制方面还没有较为系统的研究,本研究拟通过分析海藻糖对大米淀粉分子构象、水分迁移、短期回生进程与长期回生进程的影响,明确海藻糖延缓大米淀粉回生的深层机理,旨在为富含大米淀粉的方便食品的开发和品质的提高提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米,黑龙江省哈尔滨市延寿县种植的绥粳18品种,2021年当季新米,十月稻田公司;海藻糖(纯度98%),日本林源公司;其他试剂,分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

TENSOR 27型傅里叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR),德国 Bruker公司;Q2000型差示扫描量热仪(differential scanning calorimetry,DSC),美国TA公司;NMI20-060H-I型核磁共振成像分析仪,上海纽迈电子科技有限公司;CSPM4000型原子力显微镜(atomic force microscope,AFM),广州本原纳米仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1淀粉的分离及回生样品的制备

淀粉提取[8]:大米用胶体磨磨粉,大米粉、NaOH溶液(质量分数0.4%)在料液比(g/mL)1∶5的条件下,浸泡3 h后离心(如无特殊说明,本研究离心参数均为4 000 r/min、10 min),对沉淀进行水洗再离心,并重复3次,离心所得沉淀按料液比(g/mL)1∶5在体积分数95%乙醇溶液中浸泡3 h进行脱脂,沉淀物用乙醇清洗后离心(乙醇洗加离心重复3次),之后再水洗加离心2次,50 ℃烘箱干燥后粉碎过100目筛得到粗淀粉。粗淀粉配置成质量分数30%的溶液,50 ℃保持体系pH值恒定在10,加入5 mg/g的蛋白酶,缓慢搅拌反应6 h,离心取沉淀水洗后再离心(水洗加离心重复3次)以充分除去蛋白质。将沉淀溶解在蒸馏水中再调整体系pH值至7,搅拌5 min再离心,刮掉沉淀上层黑棕色物质后水洗离心(水洗加离心重复3次)。沉淀中加入等比例混合的甲醇和乙醚,搅拌1 h后再离心3次充分除去脂类,最后置于50 ℃烘箱干燥。采用凯氏定氮法(GB 5009.5—2016)测定蛋白质[9],以检测淀粉提取过程中蛋白质是否洗脱彻底;采用蒽酮比色法测定淀粉含量[10]。

称取3.5 mg大米淀粉、3.5 mg海藻糖和3.5 mg海藻糖(质量分数1.6%)-大米淀粉混合物(T-淀粉)于坩埚中,按料液比(g/mL)1∶2加入去离子水,密封后平衡过夜。用DSC对平衡样品进行糊化,加热程序:以8 ℃/min的速率从25 ℃升温至150 ℃,再以30 ℃/min的速率冷却至4 ℃。测定淀粉糊化曲线,计算糊化焓(ΔHt),并于4 ℃条件下储存0、3、24 h和3、7、21 d待用。

1.3.2直链淀粉含量的测定

将大米淀粉和T-淀粉配置成质量分数10%的悬浮液,95 ℃搅拌30 min使淀粉充分糊化,在4 ℃下冷藏3、24 h后,离心(12 000 r/min、20 min)取上清液。参照刘建垒等[11]的方法,采用双波长法测定浸出的直链淀粉含量;采用HPLC-ELSD法[12],测定T-淀粉上清液中海藻糖含量。

1.3.3淀粉分子构象表征

分别精确称取2.4 mg1.3.1节储存0、24 h的样品(水质量分数66.7%),以35 ℃去离子水,梯度稀释至样品质量分数约为0.000 8%。取稀释液3 μL平铺于云母片,温度25 ℃和相对湿度75%的条件下自然蒸发干燥。干燥后云母片采用AFM以接触模式扫描并成像。淀粉颗粒大小和形状由图像处理软件Imager 4.50分析。

1.3.4淀粉分子结构的测定

将1.3.2节中4 ℃冷藏3、24 h后的样品进行真空冷冻干燥,干燥后研磨成粉,与溴化钾按质量比1∶100混合压片后进行FTIR扫描测定。扫描波数为850～3 600 cm-1,分辨率为4 cm-1。用OMNIC分析软件分析淀粉的短程有序性。

1.3.5淀粉水分迁移的测定

采用低场核磁共振技术测定回生样品自旋-自旋弛豫时间(spin-spin relaxation time,T2)[13]。

1.3.6淀粉凝胶流变学特性的测定

参照Yang等[5]的方法,配置质量分数10%大米淀粉以及添加质量分数1.6%海藻糖的大米淀粉混合液的样品悬浮液,在磁力搅拌器不停地搅拌下取1 mL样品置于流变仪的不锈钢平台上。温度扫描程序:以5 ℃/min的加热速率从30 ℃加热到95 ℃,在95 ℃下保持3.5 min,然后再以5 ℃/min的速率从95 ℃降温至50 ℃,继续保温2.0 min。前10 s内搅拌速率为960 r/min,而后以160 r/min的搅拌速率进行测定。

扫描结束后的样品,立即进行动态频率扫描测试,动态频率扫描的测定参数:扫描温度50 ℃、角频率0.2～200 rad/s、应变1%。

1.3.7淀粉凝胶回生特性的测定

将1.3.1节中储藏24 h和3、7、21 d的样品进行热流测定,测定样品的回生焓(ΔH),测试的升温程序:以10 ℃/min的速率从25 ℃升温至150 ℃。分别计算回生1、3、7、21 d时大米淀粉和T-淀粉ΔH与ΔHt的比值,作为淀粉回生率R(%)。

1.4 数据处理

所有实验重复3次,数据表示为平均数±标准偏差。采用Excel 2019和SPSS 23.0软件进行数据分析,单因素方差分析差异显著性,采用Origin2017软件绘图。

2 结果与分析

2.1 海藻糖对大米浸出直链淀粉含量的影响

直链淀粉与支链淀粉相比,对热处理更为敏感,加热后,溶出的直链淀粉容易相互聚集,并对淀粉凝胶的形成和回生都会产生一定的影响[14]。海藻糖对大米浸出直链淀粉含量的影响见表1。由表1可知,T-淀粉中游离的直链淀粉质量比显著降低(P<0.05)。回生3 h处理后,T-淀粉的浸出直链淀粉质量比比大米淀粉降低了8.6%,随着低温储藏时间的延长,回生24 h处理后,T-淀粉浸出的直链淀粉含量比大米淀粉降低了11.5%。直链淀粉分子间的聚合重排产生的结晶,致使淀粉形成了短期回生现象,海藻糖因其特有的持水性,携水分子共同参与淀粉回生过程中分子重排的进程,抑制了直链淀粉分子之间的相互作用。回生3 h处理的T-淀粉上清液中海藻糖的质量比为1.37 mg/g,而回生24 h处理的T-淀粉上清液中海藻糖的质量比降低到1.28 mg/g(表1)。这个结果也从侧面证实了海藻糖会随着淀粉回生的进程而逐渐参与淀粉分子的重排,降低直链淀粉之间形成团聚体的可能性,从而延缓大米淀粉的回生[15],老化时间越长其抑制效果越明显。因此,海藻糖是非常有潜力和优势的抗大米淀粉老化的添加物质。

表1 海藻糖对大米浸出直链淀粉质量比的影响

2.2 海藻糖对淀粉分子有序化形态的影响

大米淀粉颗粒粒径为3～8 μm,绝大多数为支链淀粉,其含量约占淀粉总量的80%,支链淀粉一般由几千个葡萄糖残基构成,带有多分枝结构,在较高的温度下,支链淀粉被充分水化,分子结构发生伸展,有序结构被解开,分子链以单螺旋或无规则线团的形式存在。支链淀粉对糊化以及回生后淀粉的形态起决定性的作用。海藻糖对淀粉分子有序化形态的影响见图1。由图1(a)可知,刚开始糊化的大米淀粉分子呈明显的多边形凝聚状,除个别形成200 nm×500 nm左右的聚集团外,其余分布较均匀的聚集团横向为30～40 nm,纵向约为100 nm,由于淀粉单链螺旋直径约1.3 nm,等效于大部分分布均匀的聚集团内部横向排列23～30条单螺旋分子链,纵向排列大约70条单螺旋分子链,整体上糊化的淀粉分子呈现纵向排列的趋势[16-17]。回生24 h后,大米淀粉分子链横向排列更为紧凑,纵向构象趋于收缩并具有排列有序性[图1(b)]。不同于刚糊化淀粉的多边形凝聚状,回生淀粉呈现较为明显的颗粒状凝聚,且凝聚的集团整体变小,大部分大小较均匀的聚集团的横向约为30 nm,纵向为30～40 nm,与糊化态相比,表现出典型的球形或圆柱状,等效于聚集团内部横向和纵向均排列30条左右的单螺旋分子链,表明在淀粉回生过程中,淀粉分子链构象收缩,更趋于有序规则化排列[18]。T-淀粉在回生处理3 h后还具有和糊化的大米淀粉基本相似的多边形凝聚状[图1(c)];回生处理24 h,T-淀粉的分子构象收缩不显著[图1(d)],不同于图1(b)中大米淀粉表现出明显的颗粒聚集态,T-淀粉仍呈现出多边形的聚集状,且淀粉分子仍表现为纵向排列,说明海藻糖可以有效抑制淀粉分子向有序构象发生收缩重排。

图1 海藻糖对淀粉分子有序化形态的影响

2.3 海藻糖对大米淀粉分子结构的影响

利用FTIR测定了不同处理后回生样品的分子结构,见图2。所有回生样品的红外光谱在3 100～3 600 cm-1有一个宽而强的吸收峰,这是多糖分子间的羟基伸缩振动吸收峰[19]。糊化淀粉和回生24 h的淀粉羟基伸缩振动吸收峰都出现在波数3 286 cm-1左右,而回生24 h处理的T-淀粉的羟基伸缩振动吸收峰出现在3 276 cm-1,这种变化表明海藻糖的添加,可以有效增加分子之间的氢键相互作用。添加海藻糖只是引起谱带位移的变化,没有形成新的特征峰,说明海藻糖与大米淀粉之间没有发生共价结合且并未形成新的基团,只是二者之间的氢键相互作用阻碍了直链淀粉间氢键的形成[20]。

图2 不同处理后大米淀粉红外光谱

FTIR光谱波数800～1 200 cm-1可以反映淀粉的短程有序结构。1 022 cm-1和1 047 cm-1分别表示淀粉颗粒中无定形和有序(结晶)区域的数量,1 047 cm-1/1 022 cm-1的值可以表征晶体的有序程度(order degree,OD)[20],不同处理大米淀粉的OD 值见表2。大米淀粉在储藏过程中OD值发生了较大变化,大米淀粉回生24 h后OD值增加了19.0%,而T-淀粉回生24 h后OD值仅比未回生淀粉增加了3.0%,海藻糖显著降低了OD值(P<0.05),这赋予了海藻糖延缓淀粉回生程度的能力。

表2 不同处理对大米淀粉有序程度的影响

2.4 海藻糖对大米淀粉水分分布的影响

回生处理24 h后,大米淀粉与T-淀粉的水分分布见图3。由图3可知,回生处理的T-淀粉与大米淀粉样品的弛豫谱中都有强结合水、弱结合水、自由水3种不同迁移率的水分子[21],海藻糖的加入在本质上没有改变淀粉中水分的存在形式。

图3 不同处理对大米淀粉水分分布的影响

根据弛豫谱的积分结果,获得强结合水、弱结合水、自由水在淀粉中对应峰的峰面积(PA21、PA22、PA23),见表3。海藻糖的添加,增加了淀粉中的强、弱结合水的含量,二者含量的提高也导致淀粉中自由水含量被进一步压缩。在淀粉的回生过程中,淀粉链与淀粉链的结合等级优先于淀粉链与水分子的结合,回生使得在充盈水环境中完全糊化形成的淀粉链与水分子的氢键趋于不稳定而断裂,淀粉重结晶过程中结合水转变为自由水。海藻糖与暴露出来的淀粉分子链末端的自由羰基通过氢键相互作用结合,而缺失电子的羰基被水分子附着并渗透到淀粉晶型结构中去,从而导致淀粉的双螺旋重新排列。海藻糖作为小分子糖类,易自由进入淀粉分子链的内部,这是海藻糖能参与淀粉重结晶的第一个关键基础;此外,海藻糖携带的多羟基结构又可以与淀粉分子链末段暴露的羰基相互结合,二者的结合可以有效抑制淀粉分子链与链之间氢键相互作用的形成,使体系中自由水的析出以及重结晶进程受阻,大大抑制了淀粉的短期回生[22]。

表3 不同处理对大米淀粉弛豫峰面积的影响

2.5 海藻糖对大米淀粉流变学特性的影响

淀粉温度扫描结果见图4。无论添加海藻糖与否,随着温度的升高,体系的储能模量(G′)均会增强,表明糊化为体系带来的三维凝胶网络开始逐渐形成,然而当温度开始降低后,凝胶网络的刚性逐渐降低,表现为G′下降[23]。但是海藻糖的加入,致使体系整体的G′下降。根据表1的结果,添加海藻糖可以有效降低浸出直链淀粉含量,这阻碍了淀粉凝胶三维网络结构的形成,淀粉体系的刚性下降,进而导致其G′低于大米淀粉体系。本研究温度扫描实验中升温和降温时间较短,旨在阐述海藻糖对淀粉短期回生进程的影响,得到的淀粉体系刚性降低的结果再一次印证了海藻糖对大米淀粉的短期回生具有抑制作用。

图4 海藻糖对大米淀粉温度扫描曲线的影响

添加海藻糖对大米淀粉凝胶动态频率扫描曲线的影响见图5。从图5中可以看出,在角频率小于2 rad/s时,大米淀粉凝胶体系和T-淀粉凝胶体系的损耗模量(G″)均高于G′;当角频率逐渐增大后,2种凝胶体系又都表现出G′高于G″的趋势。随着扫描频率的增加,2种淀粉凝胶的G′和G″都逐渐增加,且G′高于相应的G″。在扫描范围内,2种淀粉凝胶的G′一直在升高,而当角频率大于80 rad/s后,2种淀粉凝胶的G″开始下降。对于添加了海藻糖的淀粉凝胶体系来说,G′低于而G″高于大米淀粉凝胶体系,这可能是由于海藻糖的加入使得凝胶体系中海藻糖分子和淀粉分子链间发生一定的缠结,浸出的直链淀粉减少,凝胶体系的刚性变弱,但是海藻糖与淀粉分子的纠缠却增加了混合物凝胶体系网络架构的密度[23],从而增加了体系的黏性,增大了回生重结晶的阻力。当扫描角频率大于80 rad/s后,体系的形变过大,已经超出线性黏弹区范围,凝胶体系的损耗模量开始下降,但由于海藻糖的纠缠,T-淀粉表现出对形变更好的抵抗性。

图5 海藻糖对大米淀粉动态频率扫描曲线的影响

2.6 海藻糖对淀粉长期回生特性的影响

在低温条件下贮存时,糊化后淀粉分子向低能态转变,淀粉链之间通过分子重排,以氢键结合方式形成趋向规则的晶体聚合物。淀粉ΔH为淀粉晶体聚合物发生熔融时所需要的能量,ΔH越大,说明淀粉的回生程度越大[24]。不同回生天数的大米淀粉和T-淀粉的焓变曲线如图6。2种样品的回生吸热峰均出现在45～60 ℃,随着回生时间的延长,2种样品的回生吸热峰的峰面积都逐渐增大;但是相同回生时间下,T-淀粉的回生吸热峰峰面积一直低于大米淀粉。表4为大米淀粉与T-淀粉的回生参数。由表4可知,加入海藻糖后淀粉体系的ΔH和回生度(R)均显著降低,且海藻糖带来的这种优势随着老化时间的延长而越发凸显,说明淀粉晶体堆积的能力逐渐减弱,淀粉回生程度逐渐降低。Xiao等[25]研究发现,因为多酚中的羟基易与淀粉中的羟基形成氢键,从而抑制淀粉分子聚合链的形成,使得回生淀粉的重结晶在熔融时所需的能量下降。海藻糖也含有多羟基,其抑制淀粉长期回生的机理与多酚可能类似。海藻糖比茶多酚分子更小,具有更小的空间位阻,更容易进入淀粉分子内部,除与直链淀粉发生氢键相互作用外,与支链淀粉发生纠缠的机会也更大,支链淀粉分子间的重新结晶排布,是淀粉发生长期回生的主要原因。因此,海藻糖的参与可以有效抑制支链淀粉间的氢键相互作用,从而对阻止淀粉的长期回生也同样具有积极的作用。

图6 不同回生时间大米淀粉焓变曲线

表4 大米淀粉糊化特性及低温储藏过程中的回生特性

3 结 论

研究了海藻糖影响大米淀粉回生特性的机理。结果显示,添加质量分数1.6%海藻糖的大米淀粉(T-淀粉)回生3、24 h后,浸出直链淀粉含量比大米淀粉分别降低了8.6%和11.5%,海藻糖抑制了直链淀粉的浸出重排。添加海藻糖后淀粉回生过程中分子链构象收缩被显著抑制。大米淀粉回生24 h后OD值增加了19.0%,而T-淀粉回生24 h后OD值仅比未回生淀粉增加了3.0%,表明海藻糖能显著降低大米淀粉体系的短程有序结构,延缓淀粉回生程度。比较大米淀粉和T-淀粉水分迁移的区别,发现具有优秀持水性的海藻糖使淀粉的强结合水和弱结合水含量显著增大,抑制了水分的迁移。进一步分析海藻糖对淀粉凝胶体系流变学和长期回生特性的影响,发现海藻糖不仅能够有效抑制淀粉的短期回生,对长期回生也有较好的抑制作用。