IgG N-糖基化修饰在糖尿病视网膜病变中作用的研究进展

张艺馨，蔡善君*，李智立，于伟泓，张 华

1.遵义医科大学附属医院 眼科，贵州 遵义 563003； 2.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院生物物理及结构生物学系，北京 100005； 中国医学科学院 北京协和医学院 3.北京协和医院 眼科；4.继续教育学院，北京 100730

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病(diabetes mellitus, DM)的进行性并发症，会导致患者视力障碍甚至是失明。DR可根据疾病严重程度分为：以视网膜血管异常为特征的非增殖性糖尿病视网膜病变(non-proliferative diabetic retinopathy, NPDR)、以视网膜新生血管异常为特征的增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy, PDR)和以黄斑附近视网膜增厚为特征的糖尿病黄斑水肿(diabetic macular edema, DME)。目前，由于DR患者早期无明显症状，常在晚期被诊断，且临床治疗手段如激光光凝、玻璃体内注射抗血管内皮生长因子和类固醇药物、玻璃体视网膜手术等主要适用于晚期病变[1]。遗憾的是，这些临床治疗手段只能延缓病情进展而无法达到治愈，因此迫切需要新的诊断和治疗思路。

免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)是人血浆中含量丰富的糖蛋白之一，其由可变区[F(ab)2]和片段结晶区(Fc)组成。研究发现，IgG的Fc区域的Asn297上都只有一个保守的N-糖基化修饰位点，连接1个二天线复合型聚糖，其核心结构由4个N-乙酰葡糖胺和3个甘露糖构成。不同的糖残基，如半乳糖、唾液酸和岩藻糖和平分型N-乙酰葡糖胺可以附着在这个核心上。IgG糖基化修饰受到糖基转移酶和糖苷酶基因的调控，其共价连接的聚糖影响其稳定性、半衰期、转运、溶解性和与其他蛋白质的相互作用并调节免疫反应[2]。IgG糖基化修饰的变化与疾病状态、治疗、感染、接种疫苗以及遗传和环境因素有关[3]。由于DR是以慢性炎性为特征的多因素疾病，IgG糖基化修饰的改变可能与DR发生发展相关，这从分子层面为DR的发病机制研究提供了新思路。

1 DR免疫炎性反应的相关发病机制

随着DM的进展，视网膜内出现炎性反应，包括免疫细胞激活和炎性因子释放，从而引起血管扩张和液体渗漏。视网膜内白细胞与内皮细胞相互作用增强，出现白细胞与血管内皮细胞粘附的白细胞淤滞现象[4]，这一过程导致毛细血管阻塞无灌注，炎性细胞因子和超氧化物产生损伤周围组织[5]。在DR后期，激活的中性粒细胞和单核细胞会通过受损的血-视网膜屏障渗到入到视网膜，加重炎性反应和组织损伤。此外，在PDR患者的黄斑前膜中检测到浸润的免疫细胞(如巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞)，其玻璃体样本中也含有大量巨噬细胞，提示激活的免疫细胞参与了PDR新生血管膜的形成[6]。

在DR患者血清中，循环滤泡辅助性T细胞(circulating follicular helper T cells, cTfh)的比例升高，IL-6、IL-21、IL-10和CXCL13等炎性因子分泌增加，这些变化更有效地诱导B细胞分化成为记忆B细胞和浆细胞，促进IgG和IgA的分泌[7]，表明在DR的发展进程中存在着免疫炎性反应的发生。

2 IgG N-糖基化修饰与DR相关研究

为研究DR患者IgG糖基化修饰的变化，对DM患者和DR患者IgG N-聚糖图谱进行分析，并筛选出与DR相关的聚糖生物标志物。其实验和分析包括4个主要部分：首先从2 mL血浆中分离和纯化IgG蛋白，用N-糖苷酶F将N-聚糖释放并进行荧光标记，采用超高效液相色谱技术对N-聚糖进行定性和定量分析，最后对直接测得的糖基峰 (glycan peaks, GPs)和其衍生结构(glycan traits, IGPs)进行计算。结果发现，有2个IgG糖基峰(GP15、GP20)和2个衍生结构(IGP32、IGP54)与DR显著相关，其中GP15、GP20和IGP54与DR的发生呈负相关，而IGP32与DR的发生呈正相关。这一发现在后续的相似人群中也得到了验证[8]。与之相似的另一项研究发现，在直接测量的糖基峰中，GP4、GP6、GP17和GP19在DR组水平较高，而GP15、GP16、GP18和GP21在对照组水平较高；在校正其他协变量后，10种唾液酸化修饰的聚糖在两组间具有显著差异。由此得出，唾液酸化修饰的IgG与DR的发生发展密切相关[9]。

3 IgG N-糖基化修饰类型以及在DR中的作用机制

3.1 DR中半乳糖基化修饰的作用

在DR中IgG半乳糖基化修饰水平下降，这提示机体处于促炎状态。

研究表明，半乳糖基化修饰反映了IgG的抗炎状态，低半乳糖基化修饰使IgG在糖链末端暴露于乙酰氨基葡萄糖，不易被吞噬细胞清除，不仅导致抗体与FcγRIIIa结合力降低，激活抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)[10]，而且还影响IgG的热稳定性、蛋白质聚集倾向以及与FcRn的结合，这些引起补体系统的激活，并通过替代途径诱发炎性反应[11]。其中，Fc段N-聚糖的α1-6分支链上的末端半乳糖基化修饰可促进IgG与血清补体C1q 结合，激活补体依赖的细胞毒性作用(complement-dependent cytotoxicity, CDC)[12]。并且去半乳糖化的IgG1能够诱导中性粒细胞释放活性氧(reactive oxygen species, ROS)[13]，当超过机体抗氧化能力时，引起视网膜的氧化应激，导致视网膜的神经细胞轴突变性、毛细血管细胞和神经细胞凋亡，影响视网膜结构和功能，最终导致DR的发生发展。

另外，IgG半乳糖基化修饰降低也可能是编码β1,4-半乳糖基转移酶1的基因B4GALT1表达水平降低，导致N-糖链的末端半乳糖基化水平下降。而这些由低半乳糖基化修饰的IgG引起的炎性反应可能会对视网膜造成损伤，进而影响患者视力。

3.2 DR中岩藻糖基化修饰的作用

在DR中IgG岩藻糖基化修饰水平下降，这可能引起体内ADCC增强。核心岩藻糖基化修饰水平对免疫球蛋白的功能有至关重要的影响，被认为是ADCC的“安全开关”，Fc区核心岩藻糖的缺失特异性增强了IgG与FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIIb(CD16b) Asn162聚糖的相互作用，显著增强了ADCC[14]。与高度岩藻糖基化的IgG1相比，高度去岩藻糖基化修饰的IgG1表现出更高的ADCC，两者在抗原结合方面却没有任何差异[15]。由此表明，低岩藻糖基化修饰的IgG1使ADCC增强，并进一步加重了免疫反应，造成视网膜的损伤。

3.3 DR中唾液酸化修饰的作用

在DR中发现IgG唾液酸化修饰降低，这可能与体内促炎反应增强有关。IgG Fc唾液酸化修饰可通过增强其与FcγRIIb的亲和力来增强其抗炎活性，并可通过减少其与FcγRIIIa的结合来降低ADCC作用，发挥抗炎功能[16]。在激活的B细胞中，γ-干扰素受体可以通过JAK1/2信号通路下调B细胞中α2,6-唾液酸转移酶1的表达，从而降低了IgG的Fc唾液酸化，加重了炎性反应，该过程可能在初次免疫后发生，并在较长一段时间在体内保持稳定[17]。此外，因高血糖的刺激，DR患者体内IL-6、IL-17等炎性因子著升高[18]，而这些炎性因子又可以诱导IL-17受体依赖的INF-γTfh1细胞，IL-6/IL-23依赖的IL-17A+Tfh17细胞和Tfh细胞与Foxp3+滤泡样调节性T细胞的增殖。Tfh细胞进一步诱导B细胞下调α2,6-唾液酸转移酶1的表达，从而影响IgG Fc唾液酸化[19]。此外，对于2型DM患者的研究发现，患者IgG的二天线α2,6-唾液酸化增加，而三天线α2,3-唾液酸化减少[20]，编码β-半乳糖苷α2,6-唾液酸转移酶的ST6GAL1的SNP位点与疾病易感性有关[21]，ST6GAL1在炎性反应中也发挥作用，可以合理推测，该基因在DR的IgG糖基化中也起到一定的作用。

3.4 DR中平分型N-乙酰葡糖胺修饰的作用

在DR中IgG的平分型N-乙酰葡糖胺修饰增加。IgG上较高水平的平分型N-乙酰葡糖胺修饰可增加与FcγRIII的结合力来增强ADCC，并提高 IgG 的促炎作用[22]。平分型N-乙酰葡糖胺修饰可以抑制N-聚糖末端表位生物合成，如末端岩藻糖基化、末端唾液酸化，这些末端聚糖的缺失又可增强ADCC[23]。然而，目前尚不确定ADCC的增强是直接由平分型N-乙酰葡糖胺修饰水平的变化引起还是由其他糖基化修饰水平的变化引起的。此外，平分型N-乙酰葡糖胺可以增加甘露糖结合凝集素的免疫球蛋白亲和力，其通过靶细胞的调理启动凝集素补体途径级联反应[24]。

综上，在DR中IgG N-糖基化修饰变化为：半乳糖基化、岩藻糖基化和唾液酸化降低，而平分型N-乙酰葡糖胺修饰增加。这些糖基化修饰的改变加强了IgG的ADCC和CDC，从而加重炎性反应和组织损伤，造成视网膜的病理改变。

4 问题与展望

目前，针对DR的IgG糖基化修饰的相关研究一般基于患者血清进行，对房水、玻璃体等特异性眼内容物标本缺少相关研究。另外，DR中IgG糖基化的生物学机制值得在动物或细胞水平上进一步研究。

目前对于DR的相关研究都集中于聚糖水平，缺少IgG亚类和Fc连接位点的信息。随着质谱检测等技术的发展，糖基化修饰的研究分析方法取得了很大的进展[25]。根据最终的分析对象不同，IgG N-糖基化修饰的研究大致可以分为以下三个水平：聚糖、糖肽和糖蛋白。三种水平的研究都存在其弊端。在聚糖水平分析中，需先将聚糖从IgG上酶解释放，再通过衍生化提高其稳定性和检测的灵敏度，但是该过程会一定程度上破坏聚糖结构，造成结果的偏差。在糖肽水平分析中，如何建立更有效方法对糖肽分离与富集，且准确识别IgG的连接聚糖异构体是目前需要解决的问题。而对于糖蛋白质水平分析，由于蛋白质分子量大且聚糖的占比较少，信号较低，不利于分析聚糖结构，目前很难展开大规模研究，相关的临床研究也较少。实际上，基于质谱技术的糖蛋白质组学分析仍具有挑战性。未来，方法学的进步将继续给这一领域带来革命性的变化，并加速在糖蛋白质组学领域的探索。

IgG糖基化模式和DR进展之间的确切关系仍不清楚。将糖蛋白质组学与基因组学和代谢组学的研究相结合，可能会更全面地了解DR过程中的致病机制。随着相关研究的热度增加，深入探索IgG N-糖基化修饰与DR的关系对从全新的角度探索发病机制、发现新型生物标志物、革新诊断思路和治疗方法具有重要意义。