苓桂术甘汤对压力负荷致心衰小鼠心功能、肠道屏障和菌群的影响

张红霞，陈瑶，赵鑫，邱先哲，李玉红✉

（1.天津中医药大学第二附属医院，天津 300250； 2.天津中医药大学，天津 301617）

心力衰竭（heart failure，HF）是指由于各种原因引起心脏结构或功能异常导致心室充盈障碍或射血功能下降而出现的一组复杂临床综合征［1］。2018年我国HF患病人数约450万［2］；欧美国家HF成人患病率为1%～2%，且患病率随年龄增加而增长，70岁以上人群的HF患病率超过10%［3-4］。苓桂术甘汤出自汉代张仲景《金匮要略》，具有温阳化饮、利水降逆的功效。临床研究表明苓桂术甘汤可以改善HF患者的心功能，提高患者生活质量，疗效明确［5-6］。近年来有研究表明，肠道菌群通过介导短链脂肪酸（Short－chain fatty acid，SCFA）、胆汁酸代谢等途径参与HF的疾病进展［7］。因此，本实验应用16S rRNA高通量测序，探索苓桂术甘汤对主动脉弓缩窄术（transverse aortic constriction，TAC）诱导的HF小鼠心功能、肠道屏障和肠道菌群的作用。

1 材料和方法

1.1 动物

雄性C57BL6/J小鼠，8～10周龄，40只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCKK（京）2016－0006。饲养于天津中医药大学实验动物中心，SPF级，温度（22 ± 2）℃，相对湿度50%～60%，12 h光照/黑暗环境，自由摄食、饮水。

1.2 试剂与仪器

使用DNA抽提试剂盒（美国Bio－Tek公司）；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美国Axygen公司）；FastDNASPINKitfor Soil（美国MP公司）；ZO－1（1∶1 000，Invitrogen）；Occludin（1∶1 000，Invitrogen）；βactin（1∶1 000，Santa Cruz）；Illumina MiSeq platform（美国Illumina 公司）；MISEQ测序仪和HISEQ测序仪（美国Illumina公司）；Vevo2100TMB型超高分辨率小动物超声实时影像系统（加拿大VisuaISonics Inc）。

1.3 苓桂术甘汤的制备

苓桂术甘汤由茯苓12 g，桂枝9 g，白术6 g，炙甘草6 g组成，所有药材均购自北京同仁堂股份有限公司，药材按原方比例加入蒸馏水浸泡30 min后，大火煮开并计时30 min，收集药液；再次加入蒸馏水大火煮开后计时30 min，收集药液。将两次的药液混合，浓缩，冻干制成冻干粉，保存于4 ℃冰箱。实验前，将干燥冻干粉溶于蒸馏水中。

1.4 造模与分组

小鼠适应性喂养1周后，采用主动脉弓缩窄术（TAC）模拟压力负荷诱导小鼠HF模型。手术前，小鼠禁食8 h，腹腔注射三溴乙醇（122 mg/kg）进行麻醉，用脱毛剂去除小鼠胸毛，消毒后在锁骨上方胸部中线附近切口约1～1.5 cm。采用钝性分离逐渐暴露主动脉弓，使用5-0丝线叠加27G针头，在头臂动脉和左侧颈总动脉之间结扎，结扎后立即取出针头。假手术组（Sham，n= 7）小鼠只穿线，不结扎；术后1周，将小鼠按心脏射血分数随机分为TAC模型组（TAC，n= 7）、苓桂术甘汤低剂量组（LD－L，n= 6，4.29 g/kg）和苓桂术甘汤高剂量组（LD－H，n= 7，8.58 g/kg），其中低剂量相当于人临床等效剂量，模型组灌胃蒸馏水，共8周。

1.5 心脏彩色多普勒超声仪评价小鼠心功能

在异氟烷（0.25%～0.50%）气体麻醉条件下，利用超高分辨率小动物超声仪器检测小鼠左室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter，LVESD）、左室收缩末期内径（left ventricular end systolic diameter，LVESD）、射血分数（ejection fraction，EF，%）、短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，FS，%）。结果均取3个连续心动周期的平均值。

1.6 蛋白质印迹法（Western blot）

取同一位置的结肠组织提取总蛋白并定量，电泳，转膜2 h，封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，二抗常温孵育1.5 h，TBST洗涤5次，6 min/次，使用Amersham Imager 600凝胶成像系统扫描，Image－J、Gelpro32软件计算目标条带和内参条带的灰度值，统计紧密连接带状闭合蛋白（zonula occluden，ZO）－1和紧密连接咬合蛋白（Occludin）的蛋白表达。

1.7 16S rRNA高通量测序

采用DNA提取试剂盒、NanoDrop 2000和1%琼脂糖凝胶电泳分别提取总DNA、检测DNA浓度、纯度和提取质量。使用338F：5'－ACTCCTACGGGAGGC AGCAG－3'和806R：5'－GGACTACHVGGGTWTCTA AT－3'引物在V3～V4可变区扩增后，利用Illumina MiSeq平台测序。

1.8 统计学方法

实验结果以均数 ± 标准差表示。采用SPSS22.0软件进行统计分析，多组间检验采用单因素方差分析，两组间检验采用独立样本t检验（Student'sttest或Welch'sttest）。P＜ 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 心功能

与Sham组小鼠比较，TAC组小鼠LVEDD、LVESD均显著升高（P= 0.004 7，0.000 0），EF、FS显著降低（均P= 0.000 0），提示TAC导致小鼠心脏功能严重受损，HF模型建立成功。与TAC组小鼠比较，LD－H可以显著降低LVEDD（P= 0.003 0）；LD－L和LD－H均可以显著降低LVESD（P= 0.001 6，0.000 1），并且显著升高EF、FS（P= 0.000 0），提示苓桂术甘汤可以改善TAC小鼠的心功能。结果见图1。

图1 各组HF小鼠心功能的比较

2.2 小鼠结肠组织ZO－1和Occludin蛋白相对表达水平

ZO－1和Occludin是肠道紧密连接的关键蛋白，是肠黏膜机械屏障的最主要组成部分。与Sham组比较，TAC组小鼠结肠组织中ZO－1和Occludin蛋白表达水平均显著下降（P= 0.000 0，P= 0.016 3）；与TAC组比较，LD－L、LD－H治疗均可不同程度的恢复ZO－1（P= 0.000 0，P= 0.000 0）和Occludin（P=0.041 8，P= 0.019 5）蛋白表达水平，差异具有统计意义。结果见图2。

图2 各组HF小鼠结肠组织ZO－1及Occludin蛋白表达的比较

2.3 肠道菌群的多样性

4组小鼠肠道菌群alpha多样性结果相比较，在群落丰富度（ace、sobs、chao）、多样性（shannon）、均一性（shannoneven、simpsoneven）均具有显著性差异（F=7.474 6，P= 0.001 3；F= 7.292 8，P= 0.001 4；F=9.878 7，P= 0.000 3；F= 9.561 4，P= 0.000 3；F=8.796 5，P= 0.000 5；F= 3.759 9，P= 0.025 5）。与Sham组相比，TAC组shannon（P= 0.001 4）、shannoneven（P= 0.000 9）和simpsoneven（P= 0.030 4）指数显著降低。与TAC组相比，LD－L组ace（P=0.040 9）、sobs（P= 0.038 1）、chao（P= 0.017 4）、shannon（P= 0.007 7）、shannoneven（P= 0.009 6）指数显著升高；LD－H组ace（P= 0.000 5）、sobs（P= 0.000 2）、chao（P= 0.000 1）、shannon（P= 0.000 0）、shannoneven（P= 0.000 1）、simpsoneven（P= 0.003 7）指数显著升高。说明TAC诱导的HF小鼠肠道菌群多样性和均一性降低；苓桂术甘汤有助于上调HF小鼠肠道菌群群落丰富度、多样性和均一性。基于Bray_curtis距离算法的主坐标分析（Principal Coordinates Analysis，PCoA）和UPGMA分析，可以观察小鼠肠道菌群beta多样性的差异。结果显示，PC1对总体菌群的代表性为19.62%，PC2为14.52%，各组基本可以聚集在一定的范围之内，Sham组和TAC组之间有明显的微生物群落差异，苓桂术甘汤（LD－L和LD－H）治疗后，微生物群落逐渐趋于Sham组，说明苓桂术甘汤有助于调节HF小鼠肠道菌群结构。具体见图3。

图3 各组对TAC诱导的HF小鼠肠道菌群多样性的分析

2.4 肠道细菌的相对丰度

小鼠肠道细菌中norank_f_Muribaculaceae、Lactobacillus和Akkermansia均表现出较高的丰度。在属水平方面，与Sham组相比，TAC组norank_f_Muribaculaceae和Prevotellaceae_NK3B31_group相对丰度显著较低，苓桂术甘汤治疗可以升高他们的相对丰度（与TAC组比较）。此外，苓桂术甘汤对Parabacteroides相对丰度也有上升趋势。结果见图4A。在种水平方面，uncultured_bacterium_g_norank_f_Muribaculaceae、Lactobacillus_murinus、uncul tured_bacterium_g_Prevotellaceae_NK3B31_group、uncul tured_organism_g_Parabacteroides均具有显著性差异（H= 15.391 0，P= 0.002 0；H= 8.214 0，P= 0.042 0；F= 8.048 7，P= 0.000 8；H= 10.451 0，P= 0.015 0）。结果见图4B。与Sham组相比，TAC组uncultured_bacterium_g_norank_f_Muribaculaceae相对丰度明显降低（P= 0.002 0）；Lactobacillus_murinus相对丰度升高（P= 0.042 0）。与TAC组相比，苓桂术甘汤治疗明显上调norank_f_Muribaculaceae（P= 0.028 0、0.015 0）、uncultured_bacterium_g_Prevotellaceae_NK3B31_group（P= 0.020 0）和uncultured_organism_g_Parabacteroides的相对丰度，下调Lactobacillus_murinus的相对丰度。

图4 属和种水平菌群组成分析及差异检测

2.5 关联与模型预测分析

采用Spearman相关系数，在属水平下对EF、FS、LVEDD、LVESD在不同分类水平下的肠道菌群丰度之间的相关性进行预测。在属水平方面，norank_f_Muribaculaceae与EF、FS均呈正相关；与LVEDD、LVESD均呈负相关。Lactobacillus与LVEDD、LVESD均呈正相关，与EF、FS均呈负相关。结果见图5。

图5 属水平菌群丰度与EF、FS、LVEDD、LVESD的相关性Heatmap图

3 讨论

正常情况下，肠道菌群与人体保持着共生的协调关系，参与宿主体内多种代谢，生成氧化三甲胺、SCFA和胆汁酸等，并通过激活多种信号通路影响宿主的生理过程。有研究表明，HF患者心排血量减少，导致全身充血和灌注不足、肠黏膜缺血或水肿，进而肠道通透性增加、细菌移位增加，乃至进入外周循环系统的内毒素增加，引发全身炎症反应，加重HF的疾病进展［8］。因此，肠道菌群已成为探索HF治疗领域的新视点。肠道菌群具有促进营养物质吸收、能量代谢调控、免疫功能调节等多方面功能，分别与中医理论的脾主化生气血、脾主运化、脾为之卫等方面的功能相契合，可见肠道菌群与中医之“脾”关系密切。苓桂术甘汤是温阳健脾利水的经典名方，大量临床研究证实，苓桂术甘汤可以明显改善HF患者的心功能和生活质量［5-6］。目前还没有关于苓桂术甘汤对HF小鼠肠道菌群是否具有调节作用的相关报道，故本实验采用16S rRNA高通量测序技术探究苓桂术甘汤对TAC诱导的心衰小鼠肠道菌群结构的影响。

本研究采用TAC压力负荷诱导小鼠HF模型［9］。结果表明，模型组小鼠出现明显的心功能障碍，表现为LVEDD、LVESD显著升高，EF、FS显著下降，而高、低剂量的苓桂术甘汤治疗后均可显著改善心衰小鼠的心功能。

肠屏障功能障碍是HF发生的触发因素。临床研究表明，HF患者肠壁厚度增加，肠道通透性增加以及肠道功能不全［10］。心衰患者的心排血量减少，肠道的血液灌流减少，影响了肠壁绒毛的结构，导致不同类型的肠细胞功能损伤，肠屏障的完整性受损，肠道通透性增加，从而使过量的细菌及代谢产物、内毒素进入循环系统。ZO－1和Occludin在肠黏膜损伤修复中发挥着重要作用，是衡量肠黏膜机械屏障的重要指标［11］。本研究表明，与假手术组相比，TAC组小鼠结肠组织中ZO－1、Occludin蛋白表达明显下调，提示HF小鼠肠黏膜机械屏障受损；苓桂术甘汤干预后，小鼠结肠组织ZO－1、Occludin蛋白表达水平明显升高，提示苓桂术甘汤能够保护HF小鼠肠黏膜屏障。

此外，通过对HF小鼠粪便样本进行菌群多样性分析，笔者发现HF小鼠肠道细菌多样性明显降低，细菌丰度也有下降趋势；苓桂术甘汤治疗后，细菌丰度及多样性明显升高，且结合beta多样性结果分析，苓桂术甘汤治疗后，微生物群落逐渐趋于假手术组，说明苓桂术甘汤有助于恢复HF小鼠肠道菌群的丰度和多样性。

高剂量苓桂术甘汤治疗后，Muribaculaceae相对丰度明显升高，Parabacteroides和Prevotellaceae_NK3B3 1_group相对丰度有升高趋势。有研究表明，Parabacteroides可以通过降低炎症和胰岛素抵抗水平，增强肠道完整性，进而发挥抗肥胖的作用［12］。CMATZIOURIDOU等［13］发现，Parabacteroides与抗动脉粥样硬化有关。CHEN等［14］发现，SCFA产生菌的减少可能是TAC诱导HF的显著特征，并且心衰患者中亦发现了SCFA产生菌的减少。肠道微生物介导的SCFA代谢途径可以通过多种途径抑制机体炎症反应，发挥抗HF的重要作用［15］。SMITH等［16］和LIU等［17］研究发现，Muribaculaceae、Prevotellaceae_NK3B31_group的丰度与SCFA的产生密切相关［16-17］。此外，Prevotellaceae_NK3B31_group 丰度减少，与炎症发生具有一定的相关性［18］。

此外，本实验发现，TAC小鼠肠道乳酸杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度显著增加，苓桂术甘汤能显著降低其丰度。LI等［19］和ZHENG等［20］发现，在Dahl盐敏感性高血压诱导的HF大鼠及异丙肾上腺素诱导的HF大鼠肠道中乳酸杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度均明显降低［19-20］；BOCCELLA等［21］发现，在TAC诱导的HF小鼠肠道中乳酸杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度均显著升高。并且有临床研究表明在老年HF患者和ST段抬高型心肌梗死患者肠道中，乳酸杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度均增加［17，22］。本实验发现，TAC小鼠肠道中Lactobacillus_murinus的相对丰度明显增加，苓桂术甘汤治疗后该菌相对丰度降低。Lactobacillus_murinus被认为是一种特殊的“高血压细菌”，可以调节一氧化氮水平、血管紧张素转化酶抑制剂活性和脂多糖产生［23］。此外，WILCK等［24］发现，Lactobacillus_murinus可以通过调节TH17细胞，进而预防高盐诱发的小鼠盐敏感性高血压，并且在人体肠道菌群中证实了该作用。因此，关于乳酸杆菌属（Lactobacillus）在HF疾病发展中的变化及苓桂术甘汤调节的因果关系仍需进一步的深入研究。

综上所述，本研究发现苓桂术甘汤能有效改善心衰小鼠心功能，修复肠黏膜屏障，调节肠道细菌结构紊乱，促进短链脂肪酸产生相关菌生长。