三七总皂苷调控TLR4/NLRP3/Caspase－1信号通路对骨关节炎大鼠软骨细胞焦亡的影响

蔡猛，张永宁

（1.驻马店市中心医院，河南 驻马店 463000；2.黄淮学院医学院，河南 驻马店 463000）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是临床上常见的一种老年慢性疾病，主要表现为关节软骨变性及关节周围骨质增生［1］。有学者认为，关节软骨异常炎症反应是导致OA软骨组织病变重要原因之一［2］。细胞焦亡是一种新的炎症性细胞死亡，能够诱导炎症级联放大反应，与OA的发生、发展密切相关。细胞焦亡中以Caspase－1介导的经典型细胞焦亡在OA中被广泛性研究［3-4］。研究发现，在OA大鼠模型中软骨组织焦亡相关蛋白Caspase－1、IL－1β、IL－18蛋白表达显著升高，细胞焦亡指数增加，而抑制细胞焦亡能够改善OA软骨组织损伤［5］。因此，以OA软骨细胞焦亡的角度研究药物作用机制具有重要意义。

三七总皂苷（total saponins of panax notoginseseng，PNS）是三七的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化等生物活性［6］。已有研究报道，PNS能够降低炎症因子释放，降低软骨组织炎症反应，改善OA软骨损伤［7-8］。但是目前有关PNS对OA软骨损伤的具体作用机制尚未完全阐明。本研究将基于TLR4/NLRP3/Caspase－1信号通路传导机制，拟通过构建OA大鼠模型探究PNS对OA软骨细胞焦亡的影响及可能的分子作用机制，以期为临床合理应用提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠，4～6周龄，体质量（200 ±15）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司［SCXK（京）2019－0017］，适应性喂养1周，自由饮水，昼夜交替光照，温度维持在20～25 ℃，相对湿度60%～70%。动物实验符合3R原则，且通过驻马店市中心医院动物实验伦理审查（批件号：20201002）。

1.1.2 药品与主要试剂

三七总皂苷（成都埃法生物科技有限公司，质量分数90%，批号：AF20033002）；塞来昔布（辉瑞制药有限公司，规格：200 mg/粒，国药准字J20140072）；二辛可酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、苏木素－伊红（hematoxylin and eosin staining，HE）染色试剂盒、阿尔新蓝－核固红染色试剂盒、原位末端标记（TUNEL）染色检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为P0012S、ST023、C0105S、C0153S、C1091）；番红O染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：293342）；免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：SP－9001）；TLR4一抗、NLRP3一抗、Caspase－1一抗、IL－1β一抗、IL－18一抗（美国Cell Signaling Technology公司，批号分别为14358、13158、24232、12703、57058）。

1.1.3 主要仪器

多功能酶标仪（长春乐镤科技有限公司，型号：LP－5117）；荧光倒置显微镜（日本/奥林巴斯Olympus，型号：CKX53）；高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司，型号：H3－18KR）；凝胶成像系统（美国Bio－Rad伯乐公司，型号：Gel Doc XR+）；电子压痛仪（天津诺雷信达科技有限公司，型号：YLS－3E）；足底热测痛仪（美国IITC公司，型号：HBS－1096A）。

1.2 方法

1.2.1 动物造模、分组及给药

采用改良的Hulth法［9］构建OA大鼠模型。大鼠腹腔注射3%的戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定，取左膝关节为术侧，沿左膝关节内侧剪开皮肤，充分暴露膝关节腔，切断内侧副韧带、前交叉副韧带，并摘除半月板，外科缝合线将创口缝合，期间操作避免损伤软骨组织。术后大鼠腹腔注射青霉素（20万U/d），连续3 d，预防感染。关节炎症指数 ≥ 4分，可视为造模成功。假手术组（Sham组）大鼠仅行剪开皮肤，暴露关节腔。SD大鼠随机分为Sham组，模型组（Model），三七总皂苷低、高剂量组（PNS－L、PNS－H）和阳性对照药塞来昔布组（Celecoxib），每组各10只。按照大鼠和人体等效剂量换算以及文献［10］中的干预剂量，PNS－L组和PNS－H组大鼠分别给予50、200 mg/kg PNS灌胃，1次/d，连续8周。Celecoxib组大鼠给予24 mg/kg Celecoxib灌胃，1次/d，连续8周。Sham组和Model组大鼠均给予等量生理盐水灌胃，1次/d，连续8周。

1.2.2 软骨组织病理学染色

①末次给药结束后，各组大鼠同时处死，观察膝关节软骨组织形态，并剪取相同部分的软骨组织，采用4%的多聚甲醛固定组织24 h，室温条件下将膝关节标本经EDTA溶液脱钙处理，期间脱钙溶液每3 d更换1次，脱钙时长为1个月，直至软骨组织足够柔软，然后对处理后的组织标本进行石蜡包埋、切片，切片厚度3～5 μm，软骨组织切片后进行HE染色观察病理形态变化，利用Mankin's评分表［11］对大鼠软骨组织病理损伤进行评分，Mankin's分值越高表示软骨组织损伤程度越严重；②番红O染色切片制作同HE，之后按照试剂盒检测说明书进行番红O染色；③阿尔新蓝染色切片制作同HE，之后按照试剂盒说明书进行阿尔新蓝染色，镜下观察软骨组织，并拍照。

1.2.3 大鼠压痛阈值及热痛阈值测定

给药8周后，圆筒固定大鼠，利用电子压痛仪压向大鼠患处后侧足背，当大鼠发出挣扎或是鸣叫时测定的压力值即为压痛阈值；将大鼠放置于透明的玻璃箱内，并将足底热测仪放置于大鼠患处足底，设置时间为20 s，温度为30 ℃，之后打开计时器，直至大鼠发出鸣叫或是抬腿回缩时所用时间即为热痛阈值。以上测试指标每只大鼠测定3次，取平均值为最终结果。

1.2.4 TUNEL染色检测软骨细胞焦亡

组织固定、切片制作过程同HE染色。按照TUNEL染色试剂盒进行染色，通过光学显微镜下观察并计数TUNEL阳性细胞数。其中TUNEL阳性细胞核呈亮绿色，软骨细胞核呈蓝色。每张切片随机选取6个视野，计算TUNEL阳性细胞率，即软骨细胞焦亡率。

TUNEL阳性细胞率（%）=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%

1.2.5 免疫组化法检测TLR4、NLRP3、Caspase－1阳性细胞表达

按照“1.2.2”取各组大鼠软骨组织切片，经3%H2O2溶液孵育10 min，85 ℃抗原修复，加10% BSA溶液封闭20 min；加TLR4、NLRP3、Caspase－1抗体（工作液体积稀释比例为1∶200），4 ℃孵育过夜；加对应辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育30 min；滴加二氨基联苯胺显色液，冲洗切片后进行苏木素软骨细胞核染色，于200倍视野下随机选取6个视野进行观察，拍照，利用Image J软件进行免疫组化阳性细胞比率评估TLR4、NLRP3和Caspase－1的表达。

1.2.6 Western blot检测TLR4/NLRP3/Caspase－1信号通路相关蛋白表达

给药8周后，立即将大鼠处死，剪取大鼠膝关节软骨组织并提取总蛋白，按照1∶5质量与体积比加入细胞裂解液，于4 ℃条件下裂解40 min；BCA法测定各组大鼠软骨组织蛋白质浓度；蛋白上样（按照每孔上样量30 μg计算得出上样体积）；凝胶电泳；湿转法转膜；5%BSA室温封闭2 h；分别加TLR4抗体（1∶1 000）、NLRP3抗体（1∶1 000）、Caspase－1抗体（1∶1 000）、IL－1β抗体（1∶1 000）、IL－18抗体（1∶1 000）及β－actin抗体（1∶2 000），4 ℃孵育过夜；加对应的山羊抗兔二抗或者山羊抗鼠二抗（1∶5 000），室温孵育1～2 h；TBST洗涤3次，每次5 min，滴加显影液，显影并拍照。

1.2.7 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。所有实验结果以均数 ± 标准差（±s）表示，多组间比较采用多因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P＜ 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠软骨组织病理学的比较

HE染色、番红O染色和阿尔新蓝染色显示，Sham组大鼠膝关节软骨组织结构完整，层次清晰，软骨细胞形态规则，排列整齐，无明显纤维化。Model组大鼠软骨组织退变严重，表面有严重纤维化，软骨结构完全被破坏，软骨细胞萎缩，层次杂乱，软骨细胞外基质降解明显，呈现典型的OA病理损伤改变。相比于Model组大鼠，PNS各剂量组大鼠和Celecoxib组大鼠软骨细胞形态较为正常，膝关节退变程度减轻，细胞外基质染色较深，软骨表面纤维化程度减少，OA病理损伤有一定改善。见图1。

图1 各组大鼠软骨组织病理学染色（HE，× 200）

2.2 各组大鼠病理Mankin's评分的比较

与Sham组相比，Model组大鼠Mankin's评分显著增加（P＜ 0.01）。与Model组相比，PNS各剂量组大鼠Mankin's评分显著降低（P＜ 0.05或P＜ 0.01）。见表1。

表1 各组大鼠病理损伤程度Mankin's评分比较（ ± s）

表1 各组大鼠病理损伤程度Mankin's评分比较（ ± s）

注：与Sham组相比，**P ＜ 0.01；与Model组相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

组别Sham组Model组PNS－L组PNS－H组Celecoxib组Mankin's评分（分）1.02 ± 0.18 9.87 ± 2.10**7.61 ± 1.52#4.00 ± 1.21##3.45 ± 1.02##n 剂量（mg/kg）10 10 10 10 10－－5 0 200 24

2.3 各组大鼠压痛阈值及热痛阈值的比较

与Sham组相比，Model组大鼠压痛阈值和热痛阈值均显著降低（P＜ 0.01）。与Model组相比，PNS各剂量组大鼠压痛阈值和热痛阈值均显著增加（P＜ 0.05或P＜ 0.01）。见表2。

表2 各组大鼠压痛阈值及热痛阈值比较（ ± s）

表2 各组大鼠压痛阈值及热痛阈值比较（ ± s）

注：与Sham组相比，**P ＜ 0.01；与Model组相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

组别Sham组Model组PNS－L组PNS－H组Celecoxib组热痛阈值（s）9.81 ± 1.01 5.32 ± 0.65**6.25 ± 1.02#8.32 ± 0.51##9.01 ± 0.76##n 剂量（mg/kg）10 10 10 10 10——5 0 200 24压痛阈值（g）510.32 ± 18.72 321.71 ± 19.01**417.95 ± 22.32##463.20 ± 20.11##487.57 ± 18.01##

2.4 各组大鼠软骨细胞焦亡的比较

TUNEL染色显示，与Sham组相比，Model组大鼠软骨细胞焦亡率显著增加（P＜ 0.01）。与Model组相比，PNS各剂量组大鼠软骨细胞焦亡率显著降低（P＜0.05或P＜ 0.01）。见表3、图2。

图2 各组大鼠软骨细胞焦亡情况比较（TUNEL，× 200）

表3 各组大鼠软骨细胞焦亡率比较（ ± s）

表3 各组大鼠软骨细胞焦亡率比较（ ± s）

注：与Sham组相比，**P ＜ 0.01；与Model组相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

组别Sham组Model组PNS-L组PNS-H组Celecoxib组细胞焦亡率（%）5.24 ± 1.80 30.85 ± 6.31**24.48 ± 5.12#14.77 ± 3.26##12.92 ± 3.61##n 剂量（mg/kg）10 10 10 10 10——5 0 200 24

2.5 各组大鼠软骨组织TLR4/NLRP3/Caspase－1信号通路相关蛋白的比较

免疫组化检测显示，与Sham组相比，Model组大鼠软骨细胞TLR4、NLRP3、Caspase－1阳性细胞率显著增加（P＜ 0.01）。与Model组相比，PNS各剂量大鼠软骨细胞TLR4、NLRP3、Caspase－1阳性细胞率显著降低（P＜ 0.05或P＜ 0.01）。见图3。Western blot检测信号通路相关蛋白表达。结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠软骨组织TLR4、NLRP3、Caspase－1、IL－1β、IL－18蛋白表达均显著增加（P＜ 0.01）。与Model组相比，PNS各剂量组大鼠软骨组织TLR4、NLRP3、Caspase－1、IL－1β、IL－18蛋白表达均显著降低（P＜ 0.05或P＜0.01）。见图4。

图3 免疫组化法检测各组大鼠软骨细胞TLR4、NLRP3、Caspase－1 p20阳性细胞表达率

图4 Western blot检测各组大鼠软骨组织TLR4/NLRP3/Caspase－1信号通路相关蛋白表达

3 讨论

OA已经成为骨关节外科常见疾病之一，是导致关节慢性疼痛的主要原因。预计到2030年，美国及欧洲国家OA的患病率将高达20%［12］。因此，积极探寻有效药物干预治疗OA尤为重要。目前临床上常用治疗OA药物主要有甾体类及非甾体类抗炎药、阿片类镇痛药和解热镇痛药等［13］。上述临床常用治疗药物在缓解OA疼痛症状中表现出良好的疗效，但是对OA炎症性退变进程无明显作用。

中医药在治疗OA中具有不良反应少、药效作用缓和、多靶点等明显优势［14］。OA可归于寒湿阻痹证或痹证中营卫不和等范畴，瘀血可致痹证，对痹证久者予以活血化瘀药治之［15］。OA患者不同阶段，涉及众多脏器，如肝、脾、肾等，但血瘀贯穿疾病始终，故活血化瘀治疗OA为根本大法［16］。PNS来源于三七的根茎和根部，具有消肿止痛、散瘀止血等功效［17］。研究发现PNS能够改善OA软骨损伤，其机制与抑制组织炎症反应，降低软骨细胞凋亡，促进细胞增殖密切相关［10］。本研究通过Hulth法构建OA模型，观察PNS对OA大鼠软骨损伤的影响。结果显示，PNS能够降低Mankin's评分，增加压痛阈值和热痛阈值，改善OA大鼠软骨损伤，初步表明PNS具有治疗OA功效。但是目前有关PNS治疗OA的具体分子机制尚不清楚，炎症和细胞死亡是OA的两个主要特征［18］。研究发现，细胞焦亡是继凋亡和炎症性坏死后的一种新的细胞死亡方式，广泛参与了多种炎症性疾病的发生和发展，如脓毒症、急性肺损伤及OA等［19-21］。细胞焦亡可分为Caspase－1介导的经典细胞焦亡和Caspase－4/5/11介导的非经典型细胞焦亡。既往研究发现，在OA大鼠软骨组织中细胞焦亡指数明显增加，焦亡相关蛋白Caspase－1、IL－1β和IL－18表达均明显增加，而采用Caspase－1抑制剂处理后能够明显改善OA大鼠软骨损伤［22］。众多研究已证实PNS抗炎、抗氧化等作用，并能够减轻缺氧缺糖/复氧复糖诱导的神经细胞焦亡［23］。基于以上研究笔者推测PNS可能通过抑制细胞焦亡，改善OA软骨损伤。本研究通过TUNEL染色检测软骨细胞焦亡情况。结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠软骨细胞焦亡指数明显增加；与Model组相比，PNS各剂量组大鼠软骨细胞焦亡指数明显降低。可见，PNS能够通过降低软骨细胞焦亡，改善OA软骨损伤。

Toll受体4（Toll receptor 4，TLR4）是一种模式识别受体，能够通过识别并结合内源性分子激活先天性免疫应答反应。经配体刺激TLR4，导致核转录因子－κB（nuclear transcription factor－κB，NF－κB）激活并磷酸化入核，从而启动NOD样蛋白受体3（NOD－like protein receptor 3，NLRP3）炎症小体活化，激活并促进炎症因子释放，对炎症反应过程发挥重要作用［24］。NLRP3作为Caspase－1介导细胞焦亡的关键调控蛋白。当NLRP3被激活时会促进NLRP3炎症小体组装形成复合物，继而激活Caspase－1，促进炎症因子IL－1β和IL－18表达，诱导细胞焦亡［25］。既往研究发现，在OA大鼠软骨组织中TLR4、NLRP3蛋白表达明显增加，而抑制TLR4信号传导能够明显降低NLRP3表达，从而降低组织炎症反应，改善OA损伤［26-27］。因此，以TLR4/NLRP3/Caspase－1信号通路为传导途径的细胞焦亡机制研究可能是OA疾病发生和发展中的又一重要机制。本研究利用免疫组化和Western blot检测TLR4/NLRP3/Caspase－1信号通路相关蛋白表达。结果显示，与Sham组相比，Model组大鼠软骨细胞TLR4阳性细胞率、NLRP3阳性细胞率、Caspase－1阳性细胞率以及TLR4、NLRP3和Caspase－1蛋白表达均显著增加。与Model组相比，PNS能够抑制上述蛋白表达，表明PNS能够通过抑制TLR4/NLRP3/Caspase－1信号通路活化，降低OA软骨细胞焦亡。IL－1β和IL－18已被证实可以增强软骨分解代谢，并能够通过降低蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白表达，促进软骨细胞外基质降解，并最终到OA疾病进展。本研究结果显示，PNS能够下调OA大鼠软骨组织IL－1β和IL－18蛋白表达，改善OA软骨损伤。

综上所述，本研究通过探究PNS对OA大鼠软骨细胞焦亡的影响及其作用机制。结果显示，PNS能够抑制OA大鼠软骨细胞焦亡，改善骨关节损伤，其机制可能与抑制TLR4/NLRP3/Caspase－1信号通路相关。但是本研究仍存在一定的局限性，如未能阐明PNS与TLR4/NLRP3/Caspase－1信号传导的直接/间接关系。为此，本研究后续拟通过培养原代软骨细胞，利用过表达和基因沉默等实验技术进一步阐明PNS对TLR4/NLRP3/Caspase－1信号通路介导软骨细胞焦亡的作用。