碱液预处理对柠条锦鸡儿茎理化结构及酶解的影响

2023-03-04钱倩倩苗彩云李冠华王玉芬

可再生能源 2023年2期

刘寅，钱倩倩，2，苗彩云，李冠华，2，王玉芬

（1.内蒙古大学生命科学学院牧草与特色作物生物技术教育部重点实验室，内蒙古呼和浩特 010070；2.内蒙古大学生命科学学院省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室，内蒙古呼和浩特010070）

0 引言

柠条锦鸡儿（Caragana korshinskii）是豆科锦鸡儿属灌木，广泛分布在中国西北干旱和半干旱地区，是荒漠草原防风固沙和改善环境的重要生态植物。随着树龄增长，柠条锦鸡儿的导水能力下降，叶片光合效率降低，长势变得衰弱。平茬能够促进枝条萌蘖及新根生发，增强柠条锦鸡儿对水分和营养的吸收，提高光合效率，是保证柠条锦鸡儿复壮、长势繁茂的重要手段[1]。我国的柠条锦鸡儿资源十分丰富，柠条锦鸡儿平茬产物的年产量预计超过400万t，平茬产物资源化利用，能够增加柠条锦鸡儿的林区经济效益，有助于实现柠条锦鸡儿防风固沙产业的可持续发展[2]。

目前，柠条锦鸡儿平茬产物多被用于制备颗粒饲料，但柠条锦鸡儿的木质化程度较高，口感较差，这限制了其推广使用。柠条锦鸡儿也可用于直燃发电、制备板材等，但是，总体而言，相应的产业发展并不成熟[3]。纤维素是自然界最丰富的有机物，也是柠条锦鸡儿的主要成分之一，通过酶促水解反应生成单糖，并进一步转化为其它生物质及化学产品是实现纤维素高效利用的重要途径。多样的化学组分、致密的物理结构、复杂的纤维形态，以及这些因素间的相互作用会阻碍纤维素的酶促水解反应，学者们将这种顽抗性称为抗降解屏障。预处理是破坏抗降解屏障，提高纤维素酶解糖化效率的有效手段。其中，碱液预处理具有操作简便、介质污染小、设备要求低和投资成本少等优点，已被成功应用于木材、小麦秸秆和甜菜渣等生物质[4]～[6]。

目前，有关碱液预处理柠条锦鸡儿等灌木生物质的研究报道较少。因此，本文以我国西北地区重要的生态灌木柠条锦鸡儿为研究对象，首先以粗蛋白含量和酶解还原糖得率为指标，比较了柠条锦鸡儿叶和不同径级茎的可消化性；然后以NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH3种碱溶液为反应介质，预处理柠条锦鸡儿茎，考察碱预处理对柠条锦鸡儿茎的化学组分、化学基团、结晶度、孔隙率、孔径分布和酶解还原糖得率的影响，以期阐明碱液预处理对柠条锦鸡儿等灌木生物质抗降解屏障的破坏机制，并为柠条锦鸡儿纤维素的高值转化提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

柠条锦鸡儿取自内蒙古自治区和林格尔县，样品于60℃烘干后，将叶与茎分离，并根据直径大小将茎进一步分为细茎（直径＜0.5cm）、中茎（直径为0.5～1.0cm）和粗茎（直径＞1.0cm）。将柠条锦鸡儿叶和不同径级茎分别粉碎后过40目筛，装密封袋备用。纤维素酶（Trichoderma vride G）购于上海源叶生物科技有限公司，酶活为100U/g，溴化钾（光谱纯）购于Sigma-Aldrich公司，其他试剂（国产分析纯）购于内蒙古昭程商贸有限公司。

1.2 预处理

去除柠条锦鸡儿的叶和细茎，剩余部分粉碎后过40目筛，放入100mL的蓝盖瓶中进行预处理。依据相关的碱液预处理条件和前期实验结果[7]，分别以质量分数为10%的NH3·H2O，0.1%的Ca（OH）2（溶解度仅为1.65g/L）和1%的NaOH溶液为反应介质，固液比为1∶10，温度为80℃，预处理时间为6h，反应结束后用蒸馏水冲洗样品至中性，然后60℃烘干至恒重，未经预处理的样品设为对照组。预处理过程的质量损失率WL的计算式为

式中：mA，mB分别为预处理前、后样品的质量，g。

1.3 酶解还原糖得率的测定

向100mL的锥形瓶中依次加入1.5g样品和30mL柠檬酸缓冲溶液（浓度为0.05mol/L，pH值为4.8），纤维素酶用量为20FPU/g，温度为50℃，震荡水浴48h。酶解反应结束后，离心，收集上清液，采用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖浓度。酶解还原糖得率RSY的计算式为

式中：ρ为酶促水解反应生成的还原糖浓度，mg/mL；V为酶解液体积，mL；m为样品质量，g。

1.4 化学组分的测定

采用Van Soest法（稍作改进）测定样品的化学组分。样品的初始质量为m0，样品依次经过中性洗涤剂、质量分数为7%的盐酸和72%的硫酸处理，每一步处理后，过滤残渣依次用水和丙酮洗涤，然后烘干称重，残渣质量依次记为m1，m2和m3。中性洗涤物含量（NDS）、半纤维素含量（HCel）、纤维素含量（Cel）和木质素含量（Lig）的计算式分别为

1.5 粗蛋白含量的测定

采用凯氏定氮法测定样品的粗蛋白含量。样品首先于KDN-08A型石墨消化炉中消煮1h，然后采用SKD-3000型全自动凯氏定氮仪测定样品的含氮量。粗蛋白含量CP的计算式为

式中：N为氮含量，mg/g；6.25为氮含量换算为粗蛋白质含量的平均系数。

1.6 傅里叶红外光谱的测定

采用IR-Affinity-1S型傅里叶红外光谱仪测定样品的红外吸收光谱。样品粉碎后过200目筛，称取1mg样品与99mg KBr，混合后充分研磨，在150MPa下压制10min，形成KBr锭片。扫描波长为400～4000cm-1，扫描次数为40次，分辨率为8 cm-1。

1.7 结晶度的测定

采用X'Pert PRO型X射线衍射仪测定样品的结晶度。测试条件：电压为40kV，电流为40 mA，步长为0.02°，扫描角度2θ为5～40°。结晶度指数CrI的计算式为

式中：Icr为纤维素中2θ为22～23°处的结晶区强度峰值；Iamor为纤维素中2θ为18～19°处的非晶区强度最小值。

1.8 孔径分布和孔隙率的测定

采用AutoPoreⅣ9500型压汞仪测定样品的孔径分布和孔隙率，测试温度为26℃，压力为0.00345～227.53MPa。

2 结果与分析

2.1 柠条锦鸡儿可消化性分析

柠条锦鸡儿是一类具有重要生态价值的饲用灌木，可消化性是表征植物饲用品质的重要指标，本研究从粗蛋白含量和酶解还原糖得率2个方面，比较了柠条锦鸡儿茎和叶的可消化性。柠条锦鸡儿不同部位的可消化性如图1所示。从图1可以看出，柠条锦鸡儿叶的可消化性高于茎，叶的粗蛋白含量和酶解还原糖得率分别为222.68mg/g和178.61mg/g。植物的不同器官发挥着不同的生物学功能，其组织结构上存在巨大差异，茎主要由起支撑和传输作用的维管组织构成，而叶主要由薄壁组织构成。Costa T H F的研究表明，植物的顽抗性因细胞类型而异，维管组织拥有比薄壁组织更强的抗降解性[8]。此外，叶是植物的光合器官，叶中与光合作用相关的蛋白质较为丰富。因此，柠条锦鸡儿叶的可消化性高于茎。

图1 柠条锦鸡儿不同部位的可消化性Fig.1 Digestibility of different parts of Caragana korshinskii

从图1还可以看出：柠条锦鸡儿不同径级的茎可消化性不同，其中细茎的可消化性最好，其酶解还原糖得率和粗蛋白含量分别为127.55mg/g和129.12mg/g；中茎和粗茎的可消化性较差，且无显著性差异。在植物生长过程中，随着木质素的积累，组织木质化程度增加，导致可消化性降低。因此，柠条锦鸡儿的饲用品质与茎的直径呈负相关[9]。柠条锦鸡儿叶和细茎的可消化性较好，能够直接用作饲料；而中茎和粗茎的可消化性较差，不宜直接作为饲料，但这一部分是柠条锦鸡儿生物量的主体。在实现叶、茎分级的基础上，提高中茎和粗茎的转化效率，是对柠条锦鸡儿资源化利用的关键。

2.2 碱液预处理对柠条锦鸡儿茎化学结构的影响

2.2.1 柠条锦鸡儿茎颜色和化学组成的变化

碱液预处理前后，柠条锦鸡儿茎颜色和化学组分的变化情况如图2所示。从图2（a）可以看出，碱液预处理后，样品的颜色由淡黄色变为褐色，这是由非结构组分的降解以及木质素的溶出与活化引起的[10]。其中，NH3·H2O和NaOH预处理引起的颜色变化更为明显；Ca（OH）2预处理引起的颜色变化较小，这是由于其碱性较弱。

图2 碱液预处理前后，柠条锦鸡儿茎颜色和化学组分的变化情况Fig.2 Changes of color and chemical component of stem from Caragana korshinskii before and after alkali pretreatment

从图2（b）可以看出：样品经NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH预处理后，质量损失率分别为16.95%，8.04%和22.25%；碱液预处理后，样品中的中性洗涤物含量显著降低。这是因为中性洗涤物主要是细胞内的可溶性物质，主要成分为蛋白质、脂类、灰分、单宁等，碱液处理可以破坏细胞结构，溶出其中的可溶性物质。半纤维素是具有支链的无定形多糖，经过NH3·H2O和NaOH预处理后，其含量显著减少，表明碱液预处理能去除半纤维素；半纤维素的去除使得半纤维素与木质素间的交联作用减弱。碱液预处理后，木质素含量的变化不显著，木质素的去除效率受到反应条件和样品种类的影响，通常而言，碱液预处理对木质素含量高的植物的作用效果较差[11]。经Ca（OH）2预处理后，样品中的半纤维素和木质素含量率略有增加，这是由于该碱液的碱性较弱，对半纤维素和木质素的去除能力较差，随着中性洗涤物的减少，半纤维素和木质素的含量相对增加。纤维素是一种高聚合度和高分子量的多糖化合物，分子间氢键使纤维素丝束排列紧密有序，在碱性条件下也具较高的稳定性[12]。随着其他化学组分的去除，纤维素的相对含量增加，更多的纤维素有助于产生更多的葡萄糖。

2.2.2 柠条锦鸡儿茎化学基团的变化

红外光谱是分析样品化学基团变化的常用手段。碱液预处理前后，柠条锦鸡儿茎的红外光谱如图3所示。从图3可以看出：1735cm-1附近的吸收峰减弱或消失，表明半纤维素侧链乙酰基被破坏，木质素和半纤维素间的酯键被断裂；1235cm-1和831cm-1附近的吸收峰减弱，表明木质素间的醚键被破坏，紫丁香基被去除；1161cm-1和900 cm-1附近的吸收峰增强，表明不对称C-O-C桥和β-葡萄糖苷含量增加，纤维素含量提高，这和化学组分的变化结果相一致。红外光谱表明，碱液预处理对木质素有一定去除效果但不显著，然而碱液预处理能有效地去乙酰化，破坏木质素与半纤维素间的酯键以及木质素间的醚键，进而破坏木质素与半纤维素形成的交联结构，这种交联结构的破坏有助于提高柠条锦鸡儿茎的酶解还原糖得率[13]。

图3 碱液预处理前后，柠条锦鸡儿茎的红外光谱图Fig.3 FTIR of stem from Caragana korshinskii before and after alkali pretreatment

2.3 碱液预处理对柠条锦鸡儿茎物理结构的影响

碱液预处理前后，柠条锦鸡儿茎的结晶度指数和孔隙率的变化见表1。由表1可知：对照组样品的结晶度指数为25.64%，经过NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH预处理后，样品的结晶度指数均提高，分别达到39.73%，31.87%和45.64%；对照组样品的孔隙率为72.32%，经NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH预处理后，样品的孔隙率分别提高至77.71%，78.78%和78.70%。碱液预处理可以破坏纤维素的结晶区，降低纤维素结晶度；但就木质纤维素而言，非结晶区不仅包括纤维素的无定形区，还包括中性洗涤物和半纤维素等无定形成分，结晶度的提高可能是由于中性洗涤物和半纤维素等非结晶组分的降解造成的，结晶度升高预示着结晶纤维素的暴露[14]。

表1 碱液预处理前后，柠条锦鸡儿茎的结晶度指数和孔隙率Table1 CrI and porosity of stem from Caragana korshinskii before and after alkali pretreatment

碱液预处理前后，柠条锦鸡儿茎的孔径分布如图4所示。从图4可以看出，对照组样品的最可几孔径为8055.51nm，经过NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH预处理后，样品的最可几孔径分别增大至13964.78，11326.39nm和21368.87nm。这表明碱液预处理能够破坏样品的致密结构，在样品预处理过程中，随着半纤维素和部分木质素等组分的降解，细胞壁结构被破坏，使样品的孔隙和孔径增多增大，这将有利于纤维素酶进入柠条锦鸡儿茎的孔隙内部。

图4 碱液预处理前后，柠条锦鸡儿茎的孔径分布Fig.4 Pore size distribution of stem from Caragana korshinskii before and after alkali pretreatment

2.4 碱液预处理对柠条锦鸡儿茎酶解还原糖得率的影响

碱液预处理前后，柠条锦鸡儿茎的酶解还原糖得率如图5所示。从图5可以看出，对照组样品的酶解还原糖得率仅为91.51mg/g，经NH3·H2O，Ca（OH）2和NaOH预处理后，柠条锦鸡儿茎的酶解还原糖得率均显著提高，分别达到152.57，108.08，176.72mg/g，分别提升了66.68%，17.91%，93.12%。木质纤维素生物质具有多样的化学成分和多层次的分子结构，木质素和半纤维素通过化学键交联形成的复杂致密网络结构，纤维素分子链之间由氢键有序连接形成致密的结晶区等，阻碍了酶与底物的接触和作用，进而影响纤维素酶解效率。有研究认为，相比于木质素的含量，木质素与多糖间的交联才是影响纤维素酶解效率的关键因素[15]。

图5 碱液预处理前后，柠条锦鸡儿茎的酶解还原糖得率Fig.5 RSY of stem from Caragana korshinskii before and after alkali pretreatment

本研究利用较温和的碱液预处理柠条锦鸡儿茎，降解了半纤维素，有效断裂了木质素与半纤维素之间的化学键，进而破坏了木质素与半纤维素间的网状交联，暴露出纤维素结晶区，增强了纤维素可及性，最终表现为更高的酶解还原糖得率。此前研究中，碱液预处理通常需要较严苛的条件，如高浓度碱液、高温（＞100℃）或高压，以实现木质素的溶出，从而提高生物质酶解效率[11]。本文研究结果表明，使用碱液在相对温和的条件下预处理柠条锦鸡儿茎，通过破坏关键化学交联键，改变木质纤维素结构，同样能够达到较好的预处理效果，这为柠条锦鸡儿等灌木生物质预处理工艺的建立提供了新的思路。