两种2-苯基吡啶铱配合物的合成及其在细胞中的应用

王亚轩, 于 坤, 沈舒婷, 王 慧

(皖南医学院 药学院,安徽 芜湖 241002)

荧光金属配合物因兼具有机化合物荧光量子产率高和无机化合物光热稳定性好的优势,被认为是最具有发展和应用前景的一类发光材料[1-2]。常见的荧光金属配合物主要包括具有d10电子构型的Zn(II)[3]、 Cu(II)[4], d6电子构型的Ru(II)[5]、 Ir(III)[6]、 Os(II)[7]和d8电子构型的Pt(II)[8]等。与其它金属配合物相比,铱配合物优势突出,如可调控的吸收和发射波段、较高荧光量子产率、较好耐光性以及较长磷光寿命等,在有机电致发光、离子/分子检测、有机发光二极管、生物成像以及疾病早期诊断等领域受到广泛关注[9-11]。因此开发新型金属铱配合物并研究其在生物化学领域的应用具有重要意义。

基于此,本文以常见的C^N配体2-苯基吡啶(ppy)为母体,选择邻菲罗啉衍生物作为辅助配体,引入不同的末端基团,设计并合成了两种铱配合物IrL1和IrL2(图1),其结构经核磁共振氢谱、碳谱、质谱和傅里叶红外光谱表征。研究了两种配合物在不同溶剂中的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱,并采用MTT实验和共聚焦显微成像技术研究了配合物IrL1和IrL2在HepG2细胞中的应用效果。

图1 配合物IrL1和IrL2的合成路线

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker Avance (400/600 Hz)型核磁共振仪(TMS为内标);AB SCIEX MALDI-TOF型基质辅助激光解析飞行时间质谱仪;Nicolet FTIR is5型傅里叶变换红外光谱仪(溴化钾压片);UV-5900 PC型紫外可见分光光度计;HITACHI F-4600型荧光分光光度计;Infinite 200 Pro型多功能酶标仪;Leica TCS SP8型共聚焦显微镜。

IrCl3·3H2O, 4-(2-吡啶基)-苯甲醛(>95%),邻菲啰啉(99%),对羟基苯甲醛(98%),香草醛(99%),溴丁烷(99%),上海阿拉丁试剂公司;其余试剂为分析纯,上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2 合成

(1) 配体L1的合成

在250 mL三口烧瓶中依次加入邻菲罗啉双酮[12](0.74 g, 3.50 mmol),中间体M1[13](0.62 g, 3.50 mmol),乙酸铵(5.75 g, 75.00 mmol)和75 mL冰乙酸,氮气保护下,于120 ℃反应4 h。冷却至室温,倒入大量冰水中,用NaOH溶液调pH至7,析出固体,减压抽滤,所得滤饼用甲醇重结晶得淡褐色固体L10.35 g;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.98(d,J=4.0 Hz, 2H), 8.87(d,J=8.0 Hz, 2H), 8.18(d,J=8.5 Hz, 2H), 7.79～7.77(m, 2H), 7.11(d,J=8.4 Hz, 2H), 4.02(t,J=6.4 Hz, 2H), 1.74～1.66(m, 2H), 1.49～1.38(m, 2H), 0.91(t,J=7.4 Hz, 3H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 160.31, 151.24, 148.02, 143.86, 129.94, 128.22, 123.63, 122.93, 115.28, 67.80, 31.17, 19.17, 14.14。

(2) 配合物IrL1的合成

(3) 配体L2的合成

合成方法与配体L1类似,最终得褐色固体0.29 g;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.96～8.92(m, 4H), 7.90(s, 1H), 7.85(d,J=8.3 Hz, 1H), 7.77～7.75(m, 2H), 7.11(d,J=8.3 Hz, 1H), 4.01(t,J=6.5 Hz, 2H), 3.89(s, 3H), 1.74～1.67(m, 2H), 1.47～1.40(m, 2H), 0.93(t,J=7.4 Hz, 3H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 152.28, 149.71, 149.49, 147.70, 143.65, 140.93, 140.89, 130.13, 123.99, 123.53, 119.67, 113.31, 110.44, 68.36, 56.13, 31.27, 19.21, 14.16。

(4) 配合物IrL2的合成

1.3 配合物的光学性质测试方法

将配合物IrL1和IrL2分别配成浓度为1.0 mmol·L-1的母液(溶剂为二甲基亚砜)。移取50 μL母液,分别加入5 mL容量瓶中,定容至配合物终浓度为10 μM。溶剂分别为1,4-二氧六环(DOA)、乙酸乙酯(EA)、四氢呋喃(THF)、乙醇(EtOH)、乙腈(CH3CN)、二甲基亚砜(DMSO)和PBS缓冲溶液(pH=7.40)。荧光光谱的实验参数设置为激发波长410 nm,狭缝宽度10 nm,电压500 V。

1.4 细胞毒性和细胞成像测试方法

细胞毒性实验、细胞传代和培养方法参照文献[15]。当细胞密度达到实验要求时,设置如下两组实验:(1) 10 μM配合物IrL1和IrL2分别与HepG2活细胞共培养30 min; (2)用4%多聚甲醛固定细胞15 min,移去多聚甲醛,PBS洗涤两次,分别加入10 μM配合物IrL1和IrL2的DMEM溶液,与固定细胞共培养30 min。所有细胞用PBS洗涤两次后,直接用于共聚焦成像。

2 结果与讨论

2.1 合成与表征分析

以邻菲罗啉、对羟基苯甲醛、香草醛和溴丁烷为原料,通过亲核取代反应和缩合反应等,在氮气保护下简洁高效地合成了两种有机配体L1和L2,然后与铱二氯桥化合物中间体M3在氮气保护和避光条件下进行配位反应,经过柱层析分离提纯,得到了两种阳离子型铱配合物IrL1和IrL2。

2.2 光物理性质分析

测试了配合物IrL1和IrL2在7种不同极性的常见溶剂中的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱,比较并分析两种配合物的光学性质。图2为两种配合物在不同溶剂中的紫外可见吸收光谱,从图2中可看出,配合物IrL1和IrL2在300 nm均有1个较强的吸收峰,摩尔吸收系数均大于1.0×104,可能源于配体内自旋允许的π-π*跃迁过程。在370～450 nm内出现1个中等强度的吸收峰,可能是由于自旋允许的金属到配体之间的电荷转移跃迁(MLCT)[16]。配合物IrL1和IrL2的紫外可见吸收光谱未随着溶剂极性的增加发生明显变化(除了PBS以外)。

图3为配合物IrL1和IrL2在不同溶剂中的荧光发射光谱。配合物IrL1和IrL2在乙醇中的荧光强度高于在其它溶剂中,在乙醇中配合物的激发态相比于在其它溶剂中更加稳定。这两种配合物在DOA、 CH3CN和DMSO溶剂中表现出明显的精细结构,表明其发射激发态除了具有MLCT特征外,还具有明显的3LC特征[17]。与配合物IrL2相比,配合物IrL1的荧光强度更高,但最大发射峰位置未发生明显改变,说明在配合物IrL2中引入甲氧基对整个配合物共轭程度的增加没有明显贡献。

λ/nm

2.3 细胞毒性分析

选取HepG2细胞为研究对象,采用MTT法评价配合物IrL1和IrL2与细胞共培养24 h后的细胞存活率。由图4可知,即使配合物浓度到30 μM时,细胞的存活率仍在80%以上,说明配合物IrL1和IrL2具有较低的细胞毒性,可将其用于后续的细胞成像研究。

c/μM

2.4 细胞成像分析

图5是配合物IrL1和IrL2在活细胞和固定细胞中的细胞成像图。由图5可知,两种配合物只在固定的HepG2细胞的细胞质中展现出明显的荧光信号,而在HepG2活细胞的细胞质中的荧光信号较弱。造成这种现象的原因可能是由于细胞被固定后,膜的通透性发生改变,更有利于配合物穿过细胞膜进入到细胞质。

图5 配合物IrL1或IrL2与HepG2活细胞和固定细胞共培养30 min后的共聚焦成像图

本文以2-苯基吡啶为母体,邻菲罗啉为辅助配体,合成了两种铱配合物IrL1和IrL2,系统研究了这两种配合物在不同极性溶剂中的光物理性质。生物学研究结果表明:配合物IrL1和IrL2细胞毒性低,可定位于固定细胞的细胞质中。此实验结果为后期设计合成以2-苯基吡啶为母体的铱配合物提供了实验依据。