硫化氢供体型去氢枞酸衍生物的合成及其细胞毒性

蔡隆强, 梁莉华, 朱明君, 吴亚菊, 孙金川, 宾冬琪, 李芳耀

(桂林医学院 药学院,广西 桂林 541199)

恶性肿瘤严重威胁人类健康与生命[1],已成为全球第二大死因,而药物治疗是肿瘤治疗的重要手段之一。尽管已有超过数十种抗肿瘤药物用于临床,但大部分化疗药物缺乏选择性,毒副作用大,很多靶向抗肿瘤药物容易产生耐药效应。因此,开发新型的具有更好疗效和安全性的抗肿瘤药物以及疗法是药物化学家面临的重大挑战。

天然产物具有广泛的结构多样性和多效性,是新型抗肿瘤候选药物和先导化合物的主要来源[2]。去氢枞酸(DHA)是一种含有羧基、菲环骨架的天然三环二萜类树脂酸,与许多活性天然化合物有着相似或相近的结构骨架,并且具有良好的生物相容性和生物可降解性。据最近报道,去氢枞酸衍生物具有广泛的生物和药理活性,具有抗炎[3]、抗菌[4]、抗原虫[5]、抗溃疡[6]、抗病毒[7]、抗真菌[8]、抗衰老[9]和胃保护[10]等活性。经研究发现，众多去氢枞酸衍生物对宫颈癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞和乳腺癌细胞均有较强抑制作用,并通过多种途径诱导细胞凋亡[11-14]。

硫化氢(H2S)是内源性气体信号分子,在心血管、神经、炎症反应、呼吸、消化、血液新陈代谢、炎症和肿瘤生长调节等多系统或疾病过程中具有重要的病理生理作用[15]。硫化氢供体型化合物可以实现H2S固体化,近年来该类药物在临床的应用也取得了重要进展。朱翠琳等[16]合成了新型线粒体靶向性硫化氢供体AP39,该化合物可以抑制线粒体空泡及线粒体自噬体,改善心肌梗死大鼠心肌纤维化。李勐等[17]基于非甾体抗炎药(NSAIDS),引入4-羟基硫代苯甲酰胺,得到一类NSAIDS的H2S供体分子,该类化合物不仅保留了NSAIDS的优良抗炎活性,还可以有效减轻NSAIDS的胃肠道不良反应,调节平均动脉压,改善心血管毒副作用。硫化氢供体型化合物在抗肿瘤方面也表现出了一定的治疗潜力[18]。有研究显示,4-羟基硫代苯甲酰胺是一类可释放H2S的抗肿瘤活性基团,抗炎药萘普生与H2S供体4-羟基硫代苯甲酰胺拼合形成的ATB-346对人黑色素瘤细胞有抑制增殖作用[19]。

课题组前期对去氢枞酸开展了系列研究工作[20-24],并发现了若干抗肿瘤活性化合物。因此,本文在前期研究基础上利用拼合原理将去氢枞酸通过不同碳链与H2S供体4-羟基硫代苯甲酰胺偶联获得一系列类似前药性质的“杂合体”,其合成路线如图1所示。目标化合物结构经1H NMR、13C NMR和HR-MS表征。以阿霉素(DOX)为阳性对照药,采用MTT法测定目标化合物对人肝癌细胞(HepG2)、人胃癌细胞(MGC803)、人膀胱癌细胞(T24)、人肺癌细胞(A549)和人正常肝细胞(LO2) 5种细胞株的体外细胞毒性,旨在发现新型具有抗肿瘤活性的去氢枞酸衍生物,为我国优势可再生的林化资源松香的高值化利用开辟新途径。

图1 硫化氢供体型去氢枞酸衍生物的合成路线

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

WRX-4型熔点仪(上海易测仪器设备有限公司);AVANCE AV 400 MHz型核磁共振仪(Bruker公司,CDCl3为溶剂,TMS为内标);ESQUIREHCT型质谱仪(Bruker公司);Prestige-21 FT IR型傅里叶变换红外光谱仪(Simadzu公司,KBr压片);OLYMPUS BX51型荧光倒置显微镜(OLYMPUS公司);ELX酶标仪(Bio-Tek公司)。

歧化松香(AR)购自广西梧州松脂股份有限公司;1,2-二溴乙烷(AR)、 1,3-二溴丙烷(AR)、 1,5-二溴戊烷(AR)和1,6-二溴己烷(AR)购自萨恩化学技术(上海)有限公司;4-羟基硫代苯甲酰胺(AR)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。其余试剂均为分析纯。HepG2、 MGC803、 T24、 A549和 LO2均由桂林医学院第一附属医院提供。

1.2 去氢枞酸-4-氨基硫代甲酰基苯酯(2)的合成

将去氢枞酸(0.50 g, 16.00 mmol),4-羟基硫代苯甲酰胺(0.17 g, 11.00 mmol),二环己基碳亚二亚胺(DCC)(0.22 g, 11.00 mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(26.00 mg, 0.22 mmol)溶于20 mL无水二氯甲烷中,室温下搅拌24 h, TLC监测反应(石油醚 ∶乙酸乙酯=4 ∶1,V∶V)。反应结束后,加入乙酸乙酯和蒸馏水萃取,有机层用无水硫酸钠干燥,过滤,减压蒸除溶剂。粗产物通过硅胶柱层析纯化得0.39 g白色固体2。

化合物2:淡黄色粉末0.25 g,产率53.60%, m.p.175.0～176.7 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.92～7.88(m, 2H), 7.60(s, 1H), 7.20(d,J=8.2 Hz, 2H), 7.09～7.05(m, 2H), 7.02(dd,J=8.2 Hz, 1.6 Hz, 1H), 6.91(s, 1H), 2.99～2.92(m, 2H), 2.83(dt,J=13.8 Hz, 6.9 Hz, 1H), 2.43(dd,J=12.5 Hz, 2.0 Hz, 1H), 2.39～2.33(m, 1H), 1.99(d,J=4.6 Hz, 1H), 1.86(m, 5H), 1.65～1.61(m, 2H), 1.40(s, 3H), 1.27(s, 3H), 1.24(s, 3H), 1.22(s, 3H);13C NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 201.66(C=S), 176.80(C=O), 154.23, 146.63, 145.93, 136.54, 134.46, 128.39(2C, C3′、 C5′), 126.95, 124.22, 124.10, 121.54(2C, C2′、 C6′), 48.13, 44.89, 37.94, 37.01, 36.44, 33.48, 25.14, 23.97(2C, C16、 C17), 21.97, 18.55, 16.60; HR-MSm/z: calcd for C27H34NO2S{[M+H]+}436.2310 found 436.2307。

1.3 中间体去氢枞酸溴代酯(3)的合成

化合物3参考文献[22]合成,将二溴烷烃(18.00 mmol)、去氢枞酸(1.50 g, 5.00 mmol)和无水碳酸钾(1.30 g, 10.00 mmol)溶于20 mL DMF中,加热至40 ℃,搅拌反应4 h, TLC监测反应(石油醚 ∶乙酸乙酯=2 ∶1,V∶V)。反应结束后,用乙酸乙酯(3×20 mL)萃取,合并有机层后,用饱和食盐水洗涤2次,在有机层中加入适量的无水硫酸钠干燥过夜,过滤,减压蒸除溶剂,粗产物通过硅胶柱梯度层析得化合物3。

1.4 化合物(4)的合成

将化合物3(1.00 mmol)、无水碳酸钾(0.20 g, 1.50 mmol)和4-羟基硫代苯甲酰胺(0.15 g, 1.00 mmol),溶于10 mL DMF中, 60 ℃搅拌反应10 h, TLC监测反应(石油醚 ∶乙酸乙酯=3 ∶1,V∶V)。反应结束后用二氯甲烷萃取(3×25 mL),有机层用饱和食盐水洗涤(2×30 mL),加入适量的无水硫酸钠干燥过夜,过滤,减压浓缩。粗产物通过硅胶柱层析得目标化合物4。

去氢枞酸-2′-(4-氨基硫代甲酰基苯氧基)乙酯(4a):黄色粉末0.28 g,产率61.00%, m.p.88.3～90.1 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.88～7.80(m, 2H), 7.54(s, 1H), 7.15(d,J=8.2 Hz, 1H), 7.06(s, 1H), 7.00(dd,J=8.1 Hz, 1.6 Hz, 1H), 6.90～6.86(m, 2H), 6.86(s, 1H), 4.52～4.35(m, 2H), 4.21(t, 2H), 2.87～2.77(m, 3H), 2.28(d,J=12.8 Hz, 1H), 2.24(dd,J=12.5 Hz, 2.0 Hz, 1H), 1.82(d,J=6.8 Hz, 1H), 1.74～1.61(m, 4H), 1.47～1.37(m, 2H), 1.27(s, 3H), 1.23(s, 3H), 1.21(s, 3H), 1.19(s, 3H);13C NMR(400 MHz, CDCl3)δ201.27(C=S), 178.50(C=O), 161.89, 146.86, 145.83, 134.69, 131.68, 129.10(2C, C3′、 C5′), 126.96, 124.24, 123.95, 114.18(2C, C2′、 C6′), 66.13, 62.65, 47.77, 44.75, 37.95, 36.95, 36.52, 33.47, 30.10, 25.16, 24.00(2C, C16、 C17), 21.77, 18.56, 16.51; HR-MSm/z: calcd for C29H38NO3S{[M+H]+}480.2572 found 480.2570。

去氢枞酸-3′-(4-氨基硫代甲酰基苯氧基)丙酯(4b):黄色粉末0.21 g,产率43.80%, m.p.91.5～93.2 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ7.95～7.87(m, 2H), 7.71(s, 1H), 7.24(s, 1H), 7.19(d,J=8.2 Hz,1H), 7.03(dd,J=8.1 Hz, 1.6 Hz, 1H), 6.92～6.86(m, 3H), 4.35～4.22(m, 2H), 4.11～4.08(m, 2H), 2.91～2.85(m, 2H), 2.85～2.82(m, 1H), 2.33(d,J=12.8 Hz, 1H), 2.26(dd,J=12.5 Hz, 2.0 Hz, 1H), 2.15(m, 2H), 1.89～1.82(m, 1H), 1.79～1.65(m, 4H), 1.54～1.48(m, 1H), 1.43～1.39(m, 1H), 1.30(s, 3H), 1.26(s, 3H), 1.24(s, 3H), 1.23(s, 3H);13C NMR(400 MHz, CDCl3)δ201.25(C=S), 178.58(C=O), 162.16, 146.86, 145.82, 134.58, 131.36, 129.15(2C, C3′、 C5′), 126.96, 124.20, 124.00, 114.06(2C, C2′、 C6′), 64.75, 61.25, 47.74, 44.88, 37.97, 36.97, 36.70, 33.47, 30.09, 28.53, 25.21, 24.02(2C, C16、 C17), 21.79, 18.59, 16.55; HR-MSm/z: calcd for C30H40NO3S{[M+H]+}494.2729 found 494.2727。

去氢枞酸-5′-(4-氨基硫代甲酰基苯氧基)戊酯(4c):淡黄色粉末0.22 g,产率41.60%, m.p.146.7～147.4 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ7.93～7.88(m, 2H), 7.61(s, 1H), 7.19(m, 2H), 7.03(dd,J=8.1 Hz, 1.6 Hz, 1H), 6.90(m, 1H), 6.89～6.86(m, 2H), 4.12(m, 2H), 4.03(t,J=6.3 Hz, 2H), 2.89(dd,J=9.7 Hz, 5.0 Hz, 2H), 2.84(dd,J=13.8 Hz, 6.9 Hz, 1H), 2.33(d,J=12.4 Hz, 1H), 2.28(dd,J=12.5 Hz, 1.9 Hz, 1H), 1.88(dd,J=10.4 Hz, 7.7 Hz, 1H), 1.86～1.78(m, 4H), 1.73～1.70(m, 2H), 1.66(m, 2H), 1.58～1.54(m, 2H), 1.50(m, 1H,), 1.46～1.43(m, 1H), 1.29(s, 3H), 1.25(s, 3H), 1.24(d,J=2.4 Hz, 6H);13C NMR(400 MHz, CDCl3)δ201.35(C=S), 178.67(C=O), 162.48, 146.93, 145.77, 134.66, 131.08, 129.11(2C, C3′、 C5′), 126.94, 124.24, 123.98, 114.05(2C, C2′、 C6′), 67.94, 64.37, 47.69, 44.82, 37.98, 36.99, 36.67, 33.46, 30.16, 28.68, 28.41, 25.25, 24.00(2C,C16、 C17), 22.58, 21.78, 18.63, 16.55; HR-MSm/z: calcd for C32H44NO3S{[M+H]+}522.3042 found 522.3037。

去氢枞酸-6′-(4-氨基硫代甲酰基苯氧基)己酯(4d):黄色粉末0.22 g, 产率40.10%, m.p.103.4～104.5 ℃;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ7.88(d,J=8.1 Hz, 2H,), 7.68(s, 1H), 7.23(s, 1H), 7.17(d,J=8.1 Hz, 1H), 7.00(d,J=7.8 Hz, 1H), 6.91～6.78(m, 3H), 4.14～4.01(m, 2H), 3.98(t,J=6.1 Hz, 2H), 2.85～2.71(m, 3H), 2.29(d,J=12.4 Hz, 1H), 2.24(d,J=12.4 Hz, 1H), 1.88～1.74(m, 5H), 1.65(m, 4H), 1.51～1.38(m, 6H), 1.26(s, 3H), 1.23(s, 3H), 1.20(s, 6H);13C NMR(400 MHz, CDCl3)δ201.33(C=S), 178.69(C=O), 162.54, 146.96, 145.76, 134.66, 131.06, 129.13(2C, C3′、 C5′), 126.93, 124.23, 123.98, 114.06(2C, C2′、 C6′), 68.11, 64.52, 47.68, 44.86, 38.01, 36.99, 36.68, 33.47, 30.16, 28.99, 28.59, 25.77, 25.65, 25.23, 23.99(2C, C16、 C17), 21.77, 18.64, 16.55; HR-MSm/z: calcd for C33H46NO3S{[M+H]+}536.3198 found 536.3194。

1.5 目标化合物体外细胞毒性测试

以阿霉素为阳性对照药,采用MTT法测试目标化合物对HepG2、 MGC803、 T24、 A549和LO2的抑制活性。将上述5种细胞培养在10%完全培养基中(DMEM培养基 ∶胎牛血清 ∶双抗(青链霉素)=100 ∶10 ∶1，V∶V∶V),并置于37 ℃、 5% CO2的培养箱内孵育。细胞均匀接种在96孔板中,在96孔板的四周加入相同体积的PBS,培养至细胞贴壁,分别按不同计量浓度加入阿霉素、去氢枞酸和目标化合物,孵育44 h后每孔加入20 μL的MTT(5 mg·mL-1)处理4 h,终止培养。离心后小心吸弃孔内培养基上清液,最后每孔加入150 μL的DMSO,震荡10 min,使结晶物充分溶解。用酶联免疫监测仪在490 nm的波长下测定每孔吸光度OD值,计算药物对细胞的抑制率。实验重复3次后取平均值,利用SPSS 23.0计算IC50。

2 结果与讨论

2.1 合成条件优化

将去氢枞酸和4-羟基硫代苯甲酰胺进行反应时,选择酯化反应法进行拼接,在两种催化条件下:(1) 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)/1-羟基苯并三唑(HOBT); (2) 二环己基碳二亚胺(DCC)/二甲氨基吡啶(DMAP),去氢枞酸羧基与4-羟基硫代苯甲酰胺羟基化合物完成酯化。后者产率更高,在提纯时更容易进行，不仅节约溶剂且环保。在合成化合物3时,二溴烷烃需过量3倍,其目的是为了减少双酯副产物的生成。

2.2 化合物波谱解析

在1H NMR谱图中,酰胺基团中的伯胺和苯环上的氢化学位移特征峰出现在δ6.86～8.00,连接酯基和苯氧基的亚甲基上的特征峰出现在δ3.98～4.52。在13C NMR谱图中,目标化合物C=S中碳峰出现在δ201.00附近,羰基碳的特征峰出现在δ178.00附近,并且目标化合物的质荷比(m/z)均与所设计的目标产物的分子量相吻合。由此可见,目标化合物的结构符合预期。

2.3 体外细胞毒性

采用MTT法测试了目标化合物对HepG2、 MGC803、 T24、 A549和 LO2 5种细胞株的体外细胞毒性,结果如表1所示。化合物2对A549有一定的抑制活性,IC50值为13.45±0.54 μmol·L-1,但对其它几种肿瘤细胞活性较弱,这可能为去氢枞酸与硫代苯甲酰胺通过酯键连接减弱了硫代苯甲酰胺释放H2S的能力。因此,本文通过设计不同碳链将去氢枞酸与硫代苯甲酰胺偶联,研究碳链的长度对细胞毒性的影响。结果发现,当去氢枞酸与4-羟基硫代苯甲酰胺的碳链长度增长至5个碳时(化合物4c),可明显增强对HepG2、 T24 和A549 的增殖抑制作用,IC50值分别为4.63±0.18、 6.06±0.49和5.79±0.14 μmol·L-1;碳链长度增长至6个碳时,活性又略微下降。由此可推断,抗肿瘤活性的提高与延长分子长度变化引起供体释放H2S能力变化有关,链接子以5个C为最佳,具体的作用机制仍有待后续研究加以确证。

表1 化合物的体外细胞毒性

本文利用前药原理,合成了5个新型去氢枞酸-4-羟基硫代苯甲酰胺轭合物,细胞毒性结果表明:化合物4a对A549的IC50值为7.68±0.35 μmol·L-1,化合物4d对HepG2和MGC-803细胞株有较强的抑制活性,IC50值达到微摩尔水平,而活性最为显著的是化合物4c,化合物4c对HepG2、 T24和A549细胞株的IC50值分别为4.63±0.18、 6.06±0.49和5.79±0.14 μmol·L-1,优于或接近阳性对照药阿霉素。H2S供体4-羟基硫代苯甲酰胺的引入,可显著提高母体化合物对肿瘤细胞株的抑制活性。