氨糖软骨素钙姜黄复合物对骨密度的协同作用
2023-03-03何晶邱春媚黄远英殷光玲张旭光
何晶，邱春媚，黄远英，殷光玲，张旭光
汤臣倍健股份有限公司（广州 510663）
近年来，骨质疏松症发病率逐年增长，作为重大疾病深受关注和讨论[1]。以骨密度为关键词检索，截至2022年8月，关于骨密度的注册保健食品有700余例，这些保健食品的主要功能成分为氨基葡萄糖、硫酸软骨素、钙等。补钙是治疗及预防骨质疏松的重要方式[2-3]。氨基葡萄糖可以促进软骨合成与软骨细胞生长，增加骨骼钙质摄取量，刺激黏多糖生化合成，增强滑膜液黏度，减轻患者疼痛[4-6]。硫酸软骨素可以逆转软骨损坏，增加关节滑液。软骨素通过对环氧化酶-2进行抑制，减轻关节的发炎情况；减少纤维蛋白血栓的形成，促进软骨下骨血循环[6]。软骨素与氨基葡萄糖协同作用，进一步提高改善效果，并且联合使用安全性加高，不会增加不良反应，两者的联合使用在骨关节产品中较为常见[5,7]。姜黄在我国传统医学中，具有悠久的使用历史[8]，其具有广泛的抗肿瘤、抗炎、抗氧化、清除自由基等作用。研究表明，姜黄对骨质疏松有一定治疗作用，主要是抗炎机制，以及对酶类，NF-κB、OPG/RANKL、FoxO3a/Wnt、Wnt/β-catenin、TGF-β/Smad2/3等信号通路的调控[9-11]。
通过研究一种氨糖软骨素钙姜黄复合物对骨质疏松模型大鼠的骨密度的影响，探究氨糖、软骨素、钙及姜黄在增加骨密度方面的协同作用，并对其安全性进行评估，为骨关节产品的研究与开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验样品
样品为棕黄色片剂，人体推荐摄入量4.14 g/d，按体重折合剂量0.069 g/（kg·bw）。样品中功效成分添加量约为氨基葡糖硫酸钾盐1 500 mg，硫酸软骨素500 mg，钙160 mg，姜黄素40 mg，其余为辅料用于片剂成型。样品粉碎后进行试验。
1.1.2 试验动物
骨密度试验：SPF级雌性SD大鼠（来源）。安全毒理试验：SPF级昆明种小鼠，SD大鼠（来源）。
1.1.3 仪器与设备
contrAA700连续光源原子吸收光谱仪（德国Analytik Jena）；HOLOGIC双X线骨密度仪（美国HOLOGIC）；AU680全自动生化分析仪（美国BECKMAN COULTER）。
1.2 试验方法
1.2.1 骨密度试验
1.2.1.1 卵巢切除
大鼠以30 mg/（kg·bw）的剂量注射戊巴比妥钠溶液，麻醉，切除双侧卵巢，术后注射青霉素。假手术组切除约0.5 g脂肪，保留双侧卵巢。卵巢切除后5 d，进行阴道涂片检查。
1.2.1.2 受试物给予
试验动物按体重随机分组：假手术组、卵巢切除+溶剂对照组、卵巢切除+碳酸钙对照组、卵巢切除+样品低剂量组[0.345 g/（kg·bw）]、卵巢切除+样品中剂量组[0.690 g/（kg·bw）]、卵巢切除+样品高剂量组[2.070 g/（kg·bw）]。假手术组和卵巢切除+溶剂组给予等体积的1%羧甲基纤维素，卵巢切除+碳酸钙对照组经口给予与样品高剂量组相同钙含量的碳酸钙。自试验开始，灌胃对应的受试液，试验时间为90 d。
1.2.1.3 动物生长发育指标
每周称量动物体重。
1.2.1.4 股骨骨密度及骨钙含量的测定
试验结束后，处死动物，剥离股骨，烘烤至恒重，检测股骨中点处、远心端的骨密度。
称量股骨的总质量后，检测骨钙含量。
1.2.2 安全毒理试验
1.2.2.1 小鼠急性毒性试验
采用最大耐受剂量法，选用20只试验小鼠，雌雄各半。每日经口灌胃2次（间隔4 h），每次0.2 mL/（10 g·bw），累积达20.00 g/（kg·bw）。初次灌胃前禁食16 h，灌胃后观察2周，记录试验动物状态。
1.2.2.2 Ames试验
试验采用鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型TA97a，TA98，TA100，TA102菌株，以多氯联苯诱导的大鼠肝微粒体酶（S-9）为体外代谢活化系统。试验剂量为5 000，1 000，200，40和8 μg/皿，同时设自发回变，溶剂对照和阳性突变剂对照（2-氨基芴、9-芴酮、叠氮钠、1、8-二羟基蒽醌、丝裂霉素C）。于37℃培养48 h，计数每皿菌落数。
1.2.2.3 小鼠精子畸形试验
取25只试验小鼠，随机分为5组×5只。阳性对照：0.04 g/（kg·bw）环磷酰胺；阴性对照：1%羧甲基纤维素。试验组剂量分别为10.00，5.00和2.50 g/（kg·bw）。连续5 d，每天灌胃1次，末次灌胃后的第30天处死动物，取副睾涂片，每只计数1 000个结构完整的精子，计算畸变的发生率。
1.3 试验数据统计
用SPSS等软件进行数据分析，结果以X±S表示。数据采用方差分析，先进行方差齐性检验，若方差不齐则对数据进行适当的变量转化，若仍达到未方差齐，则采用秩和检验进行统计。
2 结果与分析
2.1 氨糖软骨素钙姜黄复合物对大鼠体重的影响
由表1可见，试验前各组动物的初始体重差异没有差异显著性（P＞0.05）。假手术组大鼠的第8周末重、试验末重及增重低于溶剂对照组，差异有显著性（P＜0.05）。试验剂量组与溶剂对照组体重，增重无显著差异（P＞0.05）。通过体重及增重的阶段性检测，表明手术对大鼠产生影响，氨糖软骨素钙姜黄复合物对大鼠体重未造成不良影响。
表1 氨糖软骨素钙姜黄复合物对大鼠体重的影响
2.2 氨糖软骨素钙姜黄复合物对大鼠骨长度和骨密度的影响
由表2可见，各组试验动物的股骨长度无显著差异（P＞0.05）。假手术组，高剂量组大鼠股骨中心和远心端骨密度高于溶剂对照组，差异有显著性（P＜0.05）。高剂量氨糖软骨素钙姜黄复合物的干预，可促进大鼠骨密度的增加。氨糖、软骨素、钙及姜黄的组合使用，对骨密度有促进作用。
表2 氨糖软骨素钙姜黄复合物对大鼠骨长度和骨密度的影响
2.3 氨糖软骨素钙姜黄复合物对股骨质量和钙含量的影响
由表3可见，各组试验动物的股骨质量无显著差异（P＞0.05）。假手术组，高剂量组骨钙含量高于溶剂对照组，差异有显著性（P＜0.05），高剂量氨糖软骨素钙姜黄复合物可提高大鼠骨钙含量。复合物补充钙，同时氨糖、软骨素及姜黄也一定程度地促进钙的吸收与转化等。
表3 氨糖软骨素钙姜黄对大鼠股骨重量和钙含量的影响
2.4 氨糖软骨素钙姜黄复合物的急性毒性试验
氨糖软骨素钙姜黄复合物[20.00 g/（kg·bw）]给试验动物灌胃后，动物未见明显中毒症状，无显著的体重变化，经过14 d的观察无死亡。观察期末处死受试动物进行解剖未见明显异常，包括肝、脾、肾、肠、心、肺等主要器脏。氨糖软骨素钙姜黄复合物对雌雄小鼠的最大耐受剂量（MTD）大于20.00 g/（kg·bw），按保健食品分级标准[12]，属无毒级。
表4 氨糖软骨素钙姜黄复合物的急性毒性试验
2.5 Ames试验
由表5和表6结果可见，对TA97a、TA98、TA100、TA102这4株试验菌株，加与不加S-9，氨糖软骨素钙姜黄复合物的各剂量组回变菌落均未超过自发回变菌落数的2倍，无剂量-反应关系，为阴性[12]，氨糖、软骨素、钙及姜黄的组合使用较为安全。
表5 Ames试验结果（第1次）（X±S）
表6 Ames试验结果（第2次）（X±S）
2.6 小鼠精子畸形试验
由表7可见，氨糖软骨素钙姜黄复合物干预的各试验组的小鼠精子畸形发生率与阴性对照组比较无明显差异（P＞0.05），而阳性对照组与阴性对照组比较差异有显著性（P＜0.01）。试验表明氨糖软骨素钙姜黄复合物对小鼠精子未造成畸形[12]，氨糖、软骨素、钙及姜黄的组合经毒理评价具有一定安全性。
表7 氨糖软骨素钙姜黄复合物对小鼠精子畸形发生率的影响
3 结论
以0.345，0.690和2.070 g/（kg·bw）剂量的氨糖软骨素钙姜黄复合物给雌性去势SD大鼠灌胃90 d，2.070 g/（kg·bw）剂量组大鼠股骨中心和远心端骨密度，骨钙含量显著高于溶剂对照组（P＜0.05），氨糖软骨素钙姜黄复合物对于大鼠有增加骨密度的作用[12]。林丽萍等[7]、郁桦等[13]研究表明氨糖与软骨素协同作用促进骨密度，氨糖与软骨素可通过促进软骨增长，提高骨骼对钙的摄取，进而提高骨密度。阳春华等[14]研究软骨素加钙的干预，表明软骨素与钙联合使用可增加大鼠的骨密度。刘汝萃等[15]进行氨糖软骨素钙片的大鼠骨密度的试验，结果表明氨糖软骨素钙片可显著增加骨密度。王铜浩等[9]、李义等[11]研究姜黄对骨质疏松的影响，表明姜黄对骨密度等具有积极影响，姜黄通过抗炎、抗氧化等机制改善骨关节健康。小鼠试验表明，氨糖软骨素钙姜黄复合物对雌雄小鼠的MTD大于20.00 g/（kg·bw），属无毒级。Ames试验表明，小鼠精子畸形均为阴性。氨糖软骨素钙姜黄复合物属于实际无毒[12]。黄佳宁等[16]、林丽萍等[17]、魏庆钢[18]、李庆等[19]研究也表明氨糖、软骨素、姜黄食用安全，毒理学试验为无毒级。钙为常规膳食补充剂，也具有大量研究及食用历史[20-22]。试验中氨糖、软骨素、钙及姜黄食用安全，4种原料组合使用未造成试验动物异常。氨糖、软骨素、钙及姜黄的组合对骨密度具有协同促进作用，并且具有一定安全性，可应用于保健食品等研究与开发。
