响应面优化山楂叶总黄酮的提取工艺及体外降脂研究

牛成伟，宋涵瑶，顾浩，李长春，雷小婷

江苏食品药品职业技术学院药学院（淮安 223001）

黄芩是唇形科植物黄芩的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。山楂（Crataegus pinnatifidaBunge），又名红果、山里红等，为蔷薇科山楂属落叶乔木，全球有250余种，在中国种植资源丰富[1]。山楂味甘酸，具有消食行健、行气化瘀的功效，临床主要用来治疗食物积滞、腹痛泻痢、胸痛腹痛、痛经、吐血、便血等[2-3]。现代药理学研究表明，山楂具有抗氧化、降血脂、助消化等生物活性[4-6]。在化学成分方面，它含有黄酮类、三萜类、氨基酸等多种成分[7]。

随着社会的发展，保健安全越来越受到重视，因此研究和开发植物中的天然活性成分成为热点。而黄酮类成分作为植物中天然成分的一种，具有较高的营养价值和生理保健功能，因而也备受关注。作为药食同源植物，山楂中含有大量的黄酮类成分。临床主要使用其果实，而叶往往被丢弃，造成资源的浪费。因此，选择山楂叶作为研究对象。已有研究设计了多种从植物中提取黄酮类物质的方法。传统方法有乙醇浸提[8]，新型提取方法有酶法提取[9]、超临界萃取[10]、超声波辅助提取[11]。其中，超声波辅助提取法具有操作简单、提取工时少、提取效率高等优点。因此，试验采用简单易行的超声波辅助提取法提取山楂叶中总黄酮，通过单因素试验及响应面试验研究其最佳提取工艺，并进一步测定其降脂活性，对提高山楂资源的综合利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

山楂叶，采于江苏淮安，经江苏食品药品职业技术学院祝冬青副教授鉴定为蔷薇科植物山楂Crataegus pinnatifidaBunge的干燥叶。

芦丁（分析标准品，南京广润生物科技有限公司）；乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；月桂酸4-硝基苯酯、猪胰脂肪酶（生物试剂，阿拉丁生化科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

T6型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；HH-W420恒温水浴锅（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）；ME203E分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；SY5200-D超声仪（上海声源超声波仪器设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 山楂叶总黄酮得率的测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法[12]检测提取液中总黄酮含量，绘制得总黄酮质量浓度（Y，mg/mL）与吸光度（X）标准曲线：Y=0.250 5X-0.010 1，R2=0.997 4，按照标准曲线公式（式1）计算总黄酮得率。

式中：Y为超声波提取总黄酮得率，%；C为由标曲计算所得总黄酮质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；N为稀释倍数；W为提取用山楂叶的质量，mg。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 液料比的筛选

取适量山楂叶，精密称定，分别加入60%乙醇溶液，使60%乙醇溶液与山楂叶粉末液料比为10∶1，20∶1，30∶1，40∶1和50∶1（mL/g），超声提取30 min，研究不同液料比对山楂叶总黄酮得率的影响。

1.3.2.2 乙醇体积分数的筛选

取适量山楂叶，精密称定，按照液料比30∶1（mL/g），分别加入40%，50%，60%，70%和80%的乙醇溶液，超声提取30 min，研究不同体积分数乙醇对山楂叶总黄酮得率的影响。

1.3.2.3 提取时间的筛选

取适量山楂叶，精密称定，按照液料比30∶1（mL/g），加入60%乙醇溶液，分别超声提取15，30，45，60和75 min，研究不同提取时间对山楂叶总黄酮得率的影响。

1.3.2.4 响应面试验

根据单因素试验结果，确定乙醇体积分数（A）、液料比（B）、提取时间（C）的水平范围，以山楂叶总黄酮得率（Y）为响应值，根据Box-Behnken设计原理，用Design-Expert 12.0安排试验。因素与水平表见表1。

表1 响应面因素与水平表

1.3.2.5 体外降脂试验

取0.5 mL脂肪水解酶缓冲液（0.5 U/μL），加入0.5 mL各样品溶液（2.5，5.0，10.0，15.0和20.0 mg/mL）充分混匀后37 ℃温浴 15 min，加入0.5 mL月桂酸4-硝基苯酯充分混匀后，37 ℃下温浴15 min，于405 nm处测定吸光度。以不加酶组为空白组，以不加样品组为对照组。试验重复3次，按式（2）计算各样品对胰脂肪酶的抑制率。

式中：A1为样品组的吸光度；A2为空白组吸光度；A3为对照组吸光度。

2 结果与分析

2.1 山楂叶总黄酮提取工艺的优化

2.1.1 乙醇体积分数的影响

如图1所示，乙醇体积分数从20%增加到60%时，山楂叶总黄酮得率随着乙醇体积分数增加而逐渐升高。乙醇体积分数60%时，山楂叶总黄酮得率呈现最大值。随着乙醇体积分数继续增大，山楂叶总黄酮得率降低。因此初步选择乙醇体积分数60%。这可能是基于相似相溶的原理，乙醇体积分数60%时，溶剂和山楂叶黄酮类化合物有相似的极性，因而黄酮类化合物溶出度最大。

图1 乙醇体积分数对山楂叶总黄酮得率的影响

2.1.2 液料比的影响

如图2所示，随着液料比增加，山楂叶总黄酮得率逐渐增加。增至30∶1（mL/g）时，总黄酮得率达到最大值。液料比大于30∶1（mL/g）时，山楂叶总黄酮得率下降，这可能是溶剂过量，导致传质速度降低。因此，初步选择液料比30∶1（mL/g）。

图2 液料比对山楂叶总黄酮得率的影响

2.1.3 提取时间的影响

如图3所示，提取时间由15 min增加到45 min时，山楂叶总黄酮得率逐渐增加。然而，随着时间的延长，得率降低。可能是提取时间延长，黄酮类化合物溶解增加，进而提高山楂叶黄酮类化合物的溶出。然而，时间过长导致山楂叶黄酮类化合物的吸附，得率降低。因此，初步选择提取时间45 min。

图3 提取时间对山楂叶总黄酮得率的影响

2.1.4 响应面模型方差分析

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken试验，以乙醇体积分数（A）、液料比（B）和提取时间（C）为自变量，以山楂叶总黄酮得率为响应值，进行三因素三水平响应面优化试验，对山楂叶总黄酮提取工艺参数进行优化。具体试验方案及相应结果见表2，方差分析见表3。

表2 响应面设计方案及结果

应用Design-Expert 12.0对试验结果分析，得到山楂总黄酮得率对乙醇体积分数、液料比、提取时间的二次多项回归方程式：Y=4.35-0.117 5A-0.080 0B+0.232 5C+0.022 5AB-0.137 5AC-0.062 5BC-0.208 8A2-0.343 8B2-0.393 7C2。式中：Y为山楂叶总黄酮得率（%），A为乙醇体积分数（%），B为液料比（mL/g），C为提取时间（min）。

该模型的方差分析见表3。模型P＜0.05，说明该模型具有显著性，模型失拟项P＞0.05，说明失拟不显著，因而该模型拟合程度好。由模型的方差分析可得出乙醇体积分数（A）、提取时间（C）、乙醇体积分数与提取时间交互项（AC）及各因素的二次项对响应值有显著影响（P＜0.05），而液料比（B）、乙醇体积分数与液料比交互项（AB）、液料比与提取时间交互项（BC）对响应值具有无显著影响（P＞0.05）。各因素对响应值的影响显著性排序为C＞A＞B。

表3 方差分析

2.1.5 响应面和等高线分析

模型的响应面及等高线图结果见图4。响应面图显示乙醇体积分数、液料比、提取时间中任意1个变量取零水平时，其余2个变量对山楂叶总黄酮产率的影响。2个因素之间的交互作用可通过响应面和等高线表示。两因素交互项的三维图越陡峭，等高线呈椭圆，则表明这2个因素的交互项对响应值的影响越显著[13]。三维图的陡峭顺序为AC＞BC＞AB，即乙醇体积分数与提取时间交互项三维图最陡峭，表明乙醇体积分数与提取时间之间的交互作用对山楂叶总黄酮得率的影响显著；从等高线来看，AB与BC的等高线接近圆形，表明乙醇体积分数与液料比之间的交互作用及液料比与提取时间之间的交互作用对山楂叶总黄酮得率的影响不显著（P＞0.05），这与模型的方差分析一致。

图4 两因素的交互作用对山楂叶总黄酮得率影响的响应面及等高线图

2.1.6 最佳工艺条件的预测和验证

经Design-Expert 12.0预测模型极值点，结果显示最佳提取条件为乙醇体积分数55.84%、液料比28.35∶1（mL/g）、提取时间33.81 min。在此最佳提取条件下山楂叶总黄酮得率为4.43%。根据实际操作设计验证试验，其提取条件为乙醇体积分数56%、液料比28∶1（mL/g）、提取时间34 min，此提取条件下进行3次平行试验，山楂叶总黄酮得率为4.42%±0.08%，验证结果与预测值接近，表明该模型拟合度良好。

2.2 山楂叶总黄酮对胰脂肪酶活性的影响

胰脂肪酶主要存在于小肠中，其主要功能是对脂肪进行分解代谢，生成甘油和脂肪酸，从而吸收入血，引起血脂升高。胰脂肪酶活性受到抑制，脂肪分解降低，从而血脂降低。如图5所示，随着山楂叶总黄酮浓度的增加，其对胰脂肪酶的抑制作用增强，且具有一定的浓度依赖关系。

图5 山楂叶总黄酮对胰脂肪酶活性的影响

3 结论

山楂叶总黄酮的提取和利用是山楂叶开发研究领域的热点。试验采用超声波辅助提取法对山楂叶总黄酮进行提取。选取最可能影响产率的3个因素，即液料比、乙醇体积分数和提取时间。对3个因素的不同水平进行考察，确定合适的区间。用Design-Expert 12.0设计不同因素和水平的17组试验。根据试验结果，优化最佳提取条件：乙醇体积分数56%、液料比28∶1（mL/g）、提取时间34 min。经验证，该方法产率高，重复性好。通过体外方法评价山楂叶的降脂活性，初步试验结果显示，山楂叶总黄酮具有显著的降脂活性，为开发利用天然降脂药物的研究提供依据。